[发明专利]诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组表达载体，特别涉及一种诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体，还涉及该表达载体的构建方法和应用。

背景技术

利用基因工程技术把特定的外源基因导入植物受体中，达到改变植物性状(如抗虫、抗病、抗逆等)以及快速培育植物新品种的目的，是现代遗传育种的重要途径。

植物基因工程的核心是植物的遗传转化。植物遗传转化方法主要分为两类：即利用载体系统转化(如农杆菌介导法、脂质体法等)和直接遗传转化(如基因枪法、PEG法、电激法、显微注射法、花粉管通道法、超声波法等)。其中，农杆菌介导法是采用含有目的基因的农杆菌浸染植物受体，通过诱导抗性植物再生从而获得转基因植株。由于其具有易操作、低费用、高效率、插入片段确定性好和转基因拷贝数低等独特优点，已经成为植物遗传转化的首选方法。目前，通过农杆菌介导方法获得转基因植株的植物已达100种以上，包括水稻、玉米、马铃薯、棉花、大豆、油菜、番茄、黄瓜、苜蓿、核桃、蔬菜和牧草等。但是，该方法仍然存在以下问题：(1)一些重要植物(如木本植物、单子叶植物)的转化频率低，转化植株难于再生；(2)同种植物不同品种之间的转化频率和再生频率差异大；(3)一些在生产上运用较广的植物品种难以进行遗传转化等。研究发现，存在上述问题的主要原因在于：植物再生困难，组织培养中无法获得再生苗。

发明内容

有鉴于此，为克服现有植物遗传转化技术存在的不足，本发明的目的之一在于提供一种诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体，不仅可以利用外源基因的超量表达促进植物愈伤组织形成胚状体，再诱导形成转基因植株，显著提高植物的转化频率和再生频率，而且可以从转基因植株的基因组中有效地删除外源基因，以消除外源基因的超量表达对转基因植株的负面影响。

为达到此目的，本发明的植物双元表达载体，包含BBM基因和FLP-FRT位点特异性重组系统，所述FLP-FRT位点特异性重组系统包含FLP基因和两个同向FRT位点，所述BBM基因和FLP基因位于两个同向FRT位点之间，BBM基因由组成型启动子控制，FLP基因由诱导型启动子控制。

进一步，所述组成型启动子选自花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、甘露碱合成酶基因(mas)启动子或章鱼碱合成酶基因(ocs)启动子；

进一步，所述诱导型启动子选自热激启动子HSP18.2、Gmhsp17.5-E或Gmhsp17.5C；

进一步，所述植物为双子叶植物；

进一步，所述双子叶植物为杨树；

进一步，所述植物双元表达载体为pLFFLPBBM。

胚状体诱导是植物组织培养的常用方法，具有增殖率高、可免去生根步骤等优点。BBM(BABY BOOM)基因(核苷酸序列如SEQ ID No.14所示)来自于油菜(Brassica napus)，为AP2/ERF家族成员，在发育的胚中特异性表达，可以促进细胞分裂和体细胞胚胎的形态发生变化，起诱导植物激素的作用或提高细胞对激素的敏感性。BBM基因超量表达，可以使外植体在没有外源激素的条件下产生大量的胚状体，显著提高植物的再生频率。

FLP-FRT位点特异性重组系统来自于啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞核内2μm质粒，由FLP基因(核苷酸序列如SEQ ID No.15所示)和FLP重组识别位点(FLP recognition target，FRT)组成，重组酶FLP可催化位于同一分子上两个同向FRT(loxPFRT)位点间DNA片段的切除。由于BBM基因的超量表达会对转基因植株产生一些负面影响，如植物矮化、形成玫瑰型叶片、花器官异型和降低植物育性等，在BBM基因发挥完诱导胚状体形成和植物再生的作用后，在转基因植株中诱导FLP表达，催化位于BBM基因两侧loxPFRT位点间的重组反应，即可从转基因植株的基因组中有效地删除BBM基因，消除其对转基因植株的负面影响。