[发明专利]诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体，其特征在于：所述植物双元表达载体为pLFFLPBBM，所述pLFFLPBBM是在载体pBIN19的EcoRI和NheI酶切位点之间插入BBM基因和FLP-FRT位点特异性重组系统，所述FLP-FRT位点特异性重组系统包含FLP基因和两个同向FRT位点，所述BBM基因和FLP基因位于两个同向FRT位点之间且BBM基因位于FLP基因的下游，所述BBM基因由花椰菜花叶病毒35S启动子和NOS终止子启动和终止转录，所述FLP基因由热激启动子HSP18.2和NOS终止子启动和终止转录。

2.一种构建权利要求1所述的诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体的方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT的制备

人工合成包含两个同向FRT位点以及EcoRI、KpnI、SalI、SacI、XhoI和NheI酶切位点的DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

b、中间载体pHSP-FLP-NOS1的构建

b1、以载体pBI121为模板，以核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的引物NOS1-F和核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的引物NOS1-R为上、下游引物进行PCR扩增，获得包含终止子NOS且5’端含有XhoI酶切位点、3’端含有SacI酶切位点的DNA片段I；

b2、以载体pTT119为模板，以核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的引物HSP18.2-F和核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的引物HSP18.2-R为上、下游引物进行PCR扩增，获得包含热激启动子HSP18.2且5’端含有KpnI和SalI酶切位点、3’端含有XhoI酶切位点的DNA片段II；

b3、以载体pFLP2为模板，以核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的引物FLP-F和核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的引物FLP-R为上、下游引物进行PCR扩增，获得包含FLP基因且5’端和3’端均含有XhoI酶切位点的DNA片段III；

b4、将步骤b1所得DNA片段I用XhoI和SacI双酶切后，连接到用SalI和SacI双酶切的载体pBlueScript SK+上，获得载体pNOS1；

b5、将步骤b2所得DNA片段II用KpnI和XhoI双酶切后，连接到用KpnI和XhoI双酶切的步骤b4所得载体pNOS1上，获得载体pHSP-NOS1；

b6、将步骤b3所得DNA片段III用XhoI酶切后，连接到用XhoI酶切的步骤b5所得载体pHSP-NOS1上，获得中间载体pHSP-FLP-NOS1；

c、中间载体p35S-BBM-NOS2的构建

c1、以载体pBI121为模板，以核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的引物NOS2-F和核苷酸序列如SEQID No.9所示的引物NOS2-R为上、下游引物进行PCR扩增，获得包含终止子NOS且5’端含有XhoI酶切位点、3’端含有SalI和SacI酶切位点的DNA片段IV；

c2、以载体pBI121为模板，以核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的引物35S-F和核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的引物35S-R为上、下游引物进行PCR扩增，获得包含组成型启动子35S且5’端含有KpnI和SalI酶切位点、3’端含有XhoI酶切位点的DNA片段V；

c3、从油菜中提取总RNA，反转录成cDNA，再以所得cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的引物BBM-F和核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的引物BBM-R为上、下游引物进行PCR扩增，获得包含BBM基因且5’端和3’端均含有XhoI酶切位点的DNA片段VI；

c4、将步骤c1所得DNA片段IV用XhoI和SacI双酶切后，连接到用SalI和SacI双酶切的载体pBlueScript SK+上，获得载体pNOS2；

c5、将步骤c2所得DNA片段V用KpnI和XhoI双酶切后，连接到用KpnI和XhoI双酶切的步骤c4所得载体pNOS2上，获得载体p35S-NOS2；

c6、将步骤c3所得DNA片段VI用XhoI酶切后，连接到用XhoI酶切的步骤c5所得载体p35S-NOS2上，获得中间载体p35S-BBM-NOS2；

d、植物双元表达载体pLFFLPBBM的构建

d1、将步骤a所得DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT用EcoRI和NheI双酶切后，连接到用EcoRI和NheI双酶切去除T-DNA序列的载体pBIN19上，获得载体pLF；

d2、将步骤c所得中间载体p35S-BBM-NOS2用SacI和SalI双酶切后，获得DNA片段35S-BBM-NOS，将其插入到用SacI和SalI双酶切的步骤d1所得载体pLF上，获得载体pLFBBM；

d3、将步骤b所得中间载体pHSP-FLP-NOS1用SalI酶切后，获得DNA片段HSP-FLP-NOS，将其插入到用SalI酶切的步骤d2所得载体pLFBBM上，即获得植物双元表达载体pLFFLPBBM。

3.利用权利要求1所述的植物双元表达载体诱导胚状体形成和植物再生的方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、将植物双元表达载体pLFFLPBBM转化根瘤农杆菌，获得含有植物双元表达载体pLFFLPBBM的根瘤农杆菌；

b、将步骤a所得含有植物双元表达载体pLFFLPBBM的根瘤农杆菌浸染双子叶植物的愈伤组织，在不添加植物激素的条件下诱导植物愈伤组织形成胚状体，再诱导胚状体形成幼苗，获得转基因植株；

c、在步骤b所得转基因植株的幼苗中诱导FLP表达，从转基因植株的基因组中删除BBM基因和FLP基因。