[发明专利]一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒及制备及检测方法

权利要求书

1.一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒的制备，所述检测玉米赤霉烯酮 的ELISA测试盒，其包括洗涤液、显色液A、显色液B和终止液，其还包 括包被板、玉米赤霉烯酮标准品、玉米赤霉烯酮单抗冻干品和酶标记 的羊抗鼠抗体冻干品，其特征在于：其包括以下步骤，包被板的制备 、玉米赤霉烯酮标准品的制备、玉米赤霉烯酮单抗冻干品的制备、酶 标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备；所述包被板包被固相抗原，其可采 用96或48或24孔微孔板，用10 mmol／L ~100mmol／L  pH9~10   Na2CO3-NaHCO3的缓冲液作为包被液，将玉米赤霉烯酮-卵清蛋白(Z EN-OVA)稀释至0.1μg/m L ~1.0μg/m L，96或48或24孔微孔板各 孔加100μl，2℃~8℃放置过夜，弃去包被液，洗涤2次~5次，按加入 含1~5%牛血清白蛋白，pH 7~8的磷酸盐缓冲液，2℃~8℃封闭过夜， 弃去封闭液，吹干，板条密封后置-40℃~-20℃冷冻保存；所述玉米赤 霉烯酮标准品从玉米赤霉烯酮纯品中稀释得到，稀释液为去离子水， ZEN浓度为：0.001 ng/mL~50 ng/mL；玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白 (ZEN-BSA)偶联物的制备：将ZEN溶解在3mL~100mL吡啶中，加入羧甲基 羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加入10ml~100ml蒸馏水， 用氢氧化钠溶液调pH为8.5~9.5左右，再用二氯甲烷提取3次~5次，每 次10ml~20ml，弃去二氯甲烷，水层用盐酸溶液调pH为2.5~3.5左右， 再用二氯甲烷提取3次~6次，每次10ml~20ml，收集二氯甲烷，过无水 硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到ZEN中间产物；取ZEN中间 产物，加入3ml~50ml二氧六环，加入氯甲酸异丁酯，5℃~12℃下搅拌 反应30分钟～45分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清 白蛋白溶于5ml~50ml蒸馏水和5ml~50ml二氧六环中，用氢氧化钠溶液 调pH为8～9，5℃~12℃下搅拌反应5小时～6小时，然后，以蒸馏水进 行透析，换液3次~5次，冷冻干燥，偶联物-40℃~-20℃保存；上述反 应成分的比例为：ZEN：羧甲基羟胺盐酸盐 = (10~1000)mg ：(10 ~2000)mg ，ZEN中间产物：氯甲酸异丁酯：BSA = (10~1000)mg  ：(10~1000)μl ：(10-3000)mg；玉米赤霉烯酮-卵清蛋白(ZEN-OVA )偶联物的制备：将ZEN溶解在3mL~100mL吡啶中，加入羧甲基羟胺盐酸 盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加入10ml~100ml蒸馏水，用氢氧化 钠溶液调pH为8.5~9.5左右，再用二氯甲烷提取3次~5次，每次10ml~2 0ml，弃去二氯甲烷，水层用盐酸溶液调pH为2.5~3.5左右，再用二氯 甲烷提取3次~6次，每次10ml~20ml，收集二氯甲烷，过无水硫酸钠脱 水，过滤，低温用氮气吹干，得到ZEN中间产物；取ZEN中间产物，加 入3ml~50ml二氧六环，加入氯甲酸异丁酯，5℃~12℃ 下搅拌反应30 分钟～45分钟，将反应液滴加到卵清蛋白中，然后卵清蛋白溶于5ml~ 50ml蒸馏水和5ml~50ml二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为8～9，5℃ ~12℃ 下搅拌反应5小时～6小时，然后以蒸馏水进行透析，换液3次 ~5次，冷冻干燥，偶联物-40℃~-20℃保存；上述反应成分的比例为： ZEN：羧甲基羟胺盐酸盐 = (10~1000)mg ：(10~2000)mg ，ZEN中 间产物：氯甲酸异丁酯：OVA = (10~1000)mg ：(10~1000)μl ： (10-3000)mg；所述酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊 抗鼠抗体冻干品；所述洗涤液为含有吐温和NaN3的磷酸盐缓冲溶液； 所述显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述显 色液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为硫酸溶液。

2.根据权利要求1所述一种检测玉米赤霉烯酮的ELISA测试盒的制备：其 特征在于，所述抗玉米赤霉烯酮（ZEN）单克隆抗体及其溶液的制备： 取ZEN-BSA偶联物用生理盐水配成0.1μg/μl~10 μg/μl抗原溶液， 与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时 用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔 内直接注射，免疫剂量为10μg/只~100 μg/只小鼠，以后每隔2周~ 4周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量10μg/只~10 0 μg/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的 免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比例混 合，离心，去除上清，在50 S～90 S内将0.1~10 ml 50％分子量 为1500的聚乙二醇加至细胞中，充分混匀，使其融合，1分钟~3分钟后 加入10 ml ~50 ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止10分钟~30 分钟后离心，去除上清；将融合细胞用含5％~30％小牛血清的HAT选择 性培养基悬浮后，以最后浓度为1×104~1×106饲养细胞/0.1 ml接种 于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5％~10%CO2，35 ℃~45℃条件下培养，5天~10天后，每培养孔更换2/3 HT培养液，10 天～20天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行 筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤 筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以玉米赤霉烯酮-卵清蛋 白(ZEN-OVA)为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨 髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为（A试验 - A空白 ）/(A对照-A空白)>2.1；对分泌阳性抗体的细胞进行克隆 ；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒 置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个／m1，再取1 ml稀释20倍 ，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈 阳性为止；对10周龄～13周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3 ml/ 只～0.5 ml/只，8天～10 天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细 胞，5×105细胞/只，5 天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀， 加甘油于-40℃~-20℃保存；上述反应成分的比例为：ZEN-BSA ：生 理盐水 = (10~1000) μg ：(0.1~10)m1。