[发明专利]谷氨酸基因工程高产菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及利用基因工程技术改造谷氨酸棒杆菌得到重组谷氨酸高产菌及其制备方法与利用高产菌发酵生产谷氨酸方面的应用。

背景技术

谷氨酸是构成蛋白质的主要氨基酸之一，在食品、医药、农业方面具有广泛的应用。在食品应用方面，谷氨酸单钠盐不仅具有强烈的肉类鲜味，而且具有营养价值，因而常被用于食品调味。在医药应用方面，谷氨酸钠和谷氨酸钾注射液以及谷氨酸片可用于防治肝昏迷，解氨毒，保护肝脏，这是因为谷氨酸被人体吸收后易与血氨形成谷酞胺，从而解除代谢过程中氨的毒害作用；此外，谷氨酸钠与维生素B1、B6和葡萄糖混合可制成静脉点滴注射液，谷氨酸钙可与维生素合用，以增强钙的吸收。在农业应用方面，谷氨酸铜可作为西红柿保护性和防治性杀菌剂；谷氨酸与某些激素配合，可制成柑橘增甜剂，因为谷氨酸可增加柑橘果实的含糖量，降低其酸度；此外，谷氨酸与某些生理活性物质配合，可开发出新的植物生长调节剂；谷氨酸还和其它一些氨基酸一样可作为微肥载体。

目前谷氨酸的生产主要是利用谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum发酵生产。谷氨酸棒杆菌C.glutamicum是Kinoshita等人1957年从自然界分离得到，这是一种好氧、不产孢子的革兰氏阳性细菌，基因组大小为3282kb，它不仅能利用葡萄糖为唯一碳源进行生长，而且能利用包括乙酸和琥珀酸在内的其它有机酸和碳水化合物为唯一碳源或混合碳源进行生长。谷氨酸棒杆菌C.glutamicum为生物素缺陷型，需要补充生物素才能生长。当培养基中的生物素过量时，菌体不向细胞外分泌产生谷氨酸；当生物素被限量添加时，菌体则大量分泌产生谷氨酸，因而野生型的谷氨酸棒杆菌可通过生物素限量添加来诱导分泌产生谷氨酸。此外，在生物素过量的情况下通过添加某种表面活性剂如Twee40或Tween60也能诱导谷氨酸棒杆菌过量合成谷氨酸。

尽管已有不少有关谷氨酸棒杆菌的遗传和生理生化方面的研究，但是谷氨酸棒杆菌C.glutamicum过量合成并分泌产生谷氨酸的分子机理仍然处于研究阶段。早在1965年Takinami等人提出渗漏模型，认为谷氨酸的分泌是细胞膜物理化学特征发生变化的结果。然而最新关于谷氨酸合成代谢流方面的研究表明，谷氨酸生物合成途径的改变在谷氨酸生产中发挥关键作用，在有关几乎所有氨基酸的发酵生产研究中，代谢流的改变被认为是提高菌体生产强度最重要的因素。研究发现，在谷氨酸的生物合成途径(图1)中α-酮戊二酸脱氢酶复合体(ODHC)是关键的限速酶。生物素限量以及添加Tween40或Tween60等谷氨酸合成诱导条件均可引起ODHC活性的下降，下降的ODHC活性使代谢流在ODHC分支点处向谷氨酸合成方向流动。Kimura等人1999年发现DtsR蛋白(乙酰CoA羧化酶复合体β亚单位)活性的下降能引起ODHC活性的下降。DtsR蛋白的编码基因是dtsR1，全长1632bp。

谷氨酸的高效合成还依赖于补缺途径提供充足的草酰乙酸和乙酰CoA，因为草酰乙酸和乙酰CoA反应可以形成谷氨酸的前体柠檬酸(图1)。补缺途径被认为是谷氨酸棒杆菌过量合成谷氨酸的瓶颈之一。在谷氨酸棒杆菌C.glutamicum中主要存在两个补缺反应：一是由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)催化磷酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸(OAA)；二是丙酮酸羧化酶(PC)催化丙酮酸生成OAA。PEPC的编码基因为ppc，全长2760bp；PC编码基因为pyc，全长3423bp。PEPC的活性在谷氨酸棒杆菌中活性较低，而且相对稳定，PC的活性则相对不稳定。代谢流分析发现在以葡萄糖酸盐或丙酮酸为碳源进行氨基酸发酵时，PEPC和PC之间的碳流分布为10/90。研究还发现基因ppc缺失突变株与其野生型菌株相比，细胞生长和氨基酸合成都未受到影响，基因pyc的缺失能明显降低细胞生长和氨基酸合成，因而PC催化的补缺反应在氨基酸生产中占主导地位，是补充草酰乙酸的主要途径。

目前尚未有利用基因敲除技术敲除dtsR1与采用基因过表达技术过表达PC相结合改造谷氨酸生产菌的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产谷氨酸的基因工程菌。

本发明的另一个目的是提供上述基因工程菌的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述基因工程菌在生产谷氨酸中的应用。

本发明利用基因工程技术改造谷氨酸高产菌，通过基因敲除和过表达谷氨酸合成相关限速酶基因，改变代谢流使其向谷氨酸合成方向流动，从而对菌种进行定向改造。