[发明专利]谷氨酸基因工程高产菌及其应用

权利要求书

1.一种产谷氨酸的基因工程菌，其特征在于该菌是缺失dtsR1基因并过表达pyc基因的谷氨酸棒杆菌。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于使谷氨酸棒杆菌缺失dtsR1基因的方法包括以下步骤：

a.以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，扩增dtsR1基因上下游片断，然后将该上下游片断连接起来，形成dtsR1基因缺失片段；

b.将dtsR1基因缺失片段插入穿梭载体，构建dtsR1基因敲除载体；

c.将构建的dtsR1基因敲除载体导入谷氨酸棒杆菌，采用筛选培养基培养，所得的克隆菌即为dtsR1基因缺失的谷氨酸棒杆菌。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于使谷氨酸棒杆菌缺失dtsR1基因的方法包括以下步骤：

a.以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，通过上游片断的引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2以及下游片断引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4利用PCR法分别扩增dtsR1基因上下游片断，再通过引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.4采用overlap PCR法将dtsR1基因上下游片断连接起来，形成dtsR1基因缺失片段；

b.利用E.coli/C.glutamicum穿梭载体pK19mobsacB，插入dtsR1基因缺失片段形成dtsR1基因敲除载体；

c.将dtsR1基因敲除载体导入谷氨酸棒杆菌，接种于含有卡那霉素的培养基培养，挑选卡那抗性克隆菌再接种于含有蔗糖的培养基培养，挑选蔗糖抗性克隆菌，即得缺失dtsR1基因的谷氨酸棒杆菌。

4、根据权利要求2或3所述的基因工程菌，其特征在于dtsR1基因上游片断为dtsR1基因起始密码上游300～500bp片断；dtsR1基因下游片断为dtsR1基因终止密码下游300～500bp片断。

5.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于使谷氨酸棒杆菌过表达pyc基因的方法包括下列步骤：

a.以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，扩增pyc基因，将pyc基因插入表达载体，构建pyc基因表达载体；

b.将构建的pyc基因表达载体导入谷氨酸棒杆菌，抗性培养基培养所得抗性克隆菌即为过表达pyc基因的谷氨酸棒杆菌。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于使谷氨酸棒杆菌过表达pyc基因的方法包括下列步骤：

a.以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，通过上游引物SEQ ID No.5和下游引物SEQ IDNo.6利用PCR法扩增pyc基因，将pyc基因插入表达载体pVWEx1，构建pyc基因表达载体；

b.将构建的pyc基因表达载体导入谷氨酸棒杆菌，接种于含有卡那霉素的培养基培养所得抗性克隆菌即为过表达pyc基因的谷氨酸棒杆菌。

7.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于该基因工程菌是通过下列步骤制备得到的：

a.以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，通过上游片断的引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2以及下游片断引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4利用PCR法分别扩增dtsR1基因上下游片断，再通过引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.4采用overlap PCR法将dtsR1基因上下游片断连接起来，形成dtsR1基因缺失片段；

b.利用E.coli/C.glutamicum穿梭载体pK19mobsacB，插入dtsR1基因缺失片段形成dtsR1基因敲除载体；

c.以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，通过上游引物SEQ ID No.5和下游引物SEQ IDNo.6利用PCR法扩增pyc基因，将pyc基因插入表达载体pVWEx1，构建pyc基因表达载体；

d.将dtsR1基因敲除载体导入谷氨酸棒杆菌，接种于含有卡那霉素的培养基培养，挑选卡那抗性克隆菌再接种于含有蔗糖的培养基培养，挑选蔗糖抗性克隆菌，即得缺失dtsR1基因的谷氨酸棒杆菌；然后将pyc基因表达载体导入缺失dtsR1基因的谷氨酸棒杆菌，接种于含有卡那霉素的培养基培养，挑选卡那抗性克隆菌即得缺失dtsR1基因且过表达pyc基因的谷氨酸棒杆菌。