[发明专利]球状芽孢杆菌及其所产耐有机溶剂稳定性蛋白酶

说明书

技术领域

本发明涉及一种从中国黄海连云港海域的海水中分离得到球状芽孢杆菌DS11(Bacillus sphaericus DS11)；本发明还涉及该球状芽孢杆菌产有机溶剂稳定性蛋白酶的方法与产品。

背景技术

蛋白酶可以在水相催化肽键的水解，在有机相条件下催化肽键的合成，是目前最广泛的酶制剂之一，广泛应用于多肽合成、蛋白质加工、食品、制药、制革及洗涤剂等领域。蛋白酶在有机相催化肽合成时，要求蛋白酶耐受有机溶剂。但是，有机溶剂对大多数酶类具有较强的毒害作用。通过酶的化学修饰、包埋、固定、蛋白质工程和定向进化等手段可以提高酶对有机溶剂的耐受性。但是这些方法成本高、操作复杂，如果酶在有机溶剂存在的情况下具有高活性和稳定性，可以大大简化工序，降低成本。

耐有机溶剂极端微生物是可以在较高浓度有机溶剂存在的环境中生长繁殖的一类微生物。耐有机溶剂极端微生物往往产生有机溶剂稳定性酶类，如脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶。因此筛选耐有机溶剂极端微生物成为获得有机溶剂稳定性酶的主要手段。目前只发现Pseudomonas aeruginosa和Bacillus sp.可以产生耐有机溶剂蛋白酶。且并没有进行工业化生产，难以满足市场的需要。

国内关于耐有机溶剂微生物及有机溶剂酶稳定性类研究报道较少，目前国内尚没有球状芽孢杆菌产有机溶剂稳定性蛋白酶的报道。筛选新型的有机溶剂稳定性蛋白酶，对于丰富有机溶剂稳定性蛋白酶种类，满足工业化生产需要和研究蛋白酶有机溶剂稳定性机制奠定基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种通过球状芽孢杆菌(Bacillus sphaericus DS11)DS11来生产有机溶剂稳定性蛋白酶的方法。

本发明还公开了上述方法所产有机溶剂稳定性蛋白酶的性质。

本发明还公开了球状芽孢杆菌(Bacillus sphaericus DS11)DS11的分离培养方法。

本发明中所涉及的生物材料球状芽孢杆菌DS11(Bacillus sphaericusDS11)菌株是一种公开的菌株，已于2008年8月4日在Genebank公开，该菌株的16S rDNA序列也已在Genebank公开，其长度为1467bp，登录号为：EU835735，网址为：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nuccore&id＝194716764。

该菌株为公知公用材料，在该专利申请日起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。

本发明是在上述公开的球状芽孢杆菌DS11(Bacillus sphaericus DS11)菌株的基础上研究其产机溶剂稳定性蛋白酶及产酶方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种球状芽孢杆菌DS11(Bacillus sphaericus DS11)，其特点是，它采用以下方法进行分离培养，将取自中国黄海连云港海域的海水水样1ml添加到250ml三角瓶装有50mL含10％苯的MLB液体培养基中，用橡胶塞塞住瓶口，28℃，160r/min培养4d后转接到新的MLB液体培养基中，如是3次；将所得培养液稀释10⁵倍后，吸取10μl涂布MLB培养基平板，在28℃培养箱中培养2d，观察菌落形态，划线纯化至纯种后点种于SMA培养基平板，在28℃培养箱中培养2d，初步筛选出菌落直径与透明圈直径的比值大于5的菌株，并将初筛菌株分别接种到产酶发酵培养基，28℃，180r/min培养48h后，4℃下8000g离心10min，测定上清液蛋白酶活性；分别取1mL上清液加入1mL苯，在30℃，180r/min振荡处理1h后检测蛋白酶活力，苯处理前后蛋白酶活性降低最小的菌株即为球状芽孢杆菌DS11(Bacillussphaericus DS11)。

以下的发明人所做的关于菌株的鉴定。

1.1形态特征：革兰氏阳性、短杆状、大小为2.2-2.7μm×0.7-1.3μm、无荚膜、有芽孢。

1.2在脱脂乳(SMA)固体培养基上的菌落特征：直径2mm-4mm，白色、湿润、边缘光滑、中间突起、易挑取，产生明显的透明圈。

1.3生理生化特征：