[发明专利]球状芽孢杆菌及其所产耐有机溶剂稳定性蛋白酶

权利要求书

1.一种球状芽孢杆菌DS11(Bacillus sphaericus DS11)，其特征在于，它采用以下方法进行分离培养，将取自中国黄海连云港海域的海水水样1ml添加到250ml三角瓶装有50mL含10％苯的MLB液体培养基中，用橡胶塞塞住瓶口，28℃，160r/min培养4d后转接到新的MLB液体培养基中，如是3次；将所得培养液稀释10⁵倍后，吸取10μl涂布MLB培养基平板，在28℃培养箱中培养2d，观察菌落形态，划线纯化至纯种后点种于SMA培养基平板，在28℃培养箱中培养2d，初步筛选出菌落直径与透明圈直径的比值大于5的菌株，并将初筛菌株分别接种到产酶发酵培养基，28℃，180r/min培养48h后，4℃下8000g离心10min，测定上清液蛋白酶活性；分别取1mL上清液加入1mL苯，在30℃，180r/min振荡处理1h后检测蛋白酶活力，苯处理前后蛋白酶活性降低最小的菌株即为球状芽孢杆菌DS11(Bacillus sphaericus DS11)。

2.根据权利要求1所述的一种球状芽孢杆菌DS11(Bacillus sphaericusDS11)，其特征在于，所得球状芽孢杆菌DS11(Bacillus sphaericusDS11)菌株具有以下特征：

1)生长特征：菌株的生长温度范围为5-45℃，最适生长温度为28℃；生长pH范围为4-11，最适生长pH为7；生长的NaCl浓度为0.3％-10％，最适生长的NaCl浓度为3％；

2)菌体特征：革兰氏阳性、短杆状、大小为2.2-2.7μm×0.7-1.3μm、无荚膜、有芽孢；

3)在脱脂乳固体培养基上的菌落特征：直径2mm-4mm，白色、湿润、边缘光滑、中间突起、易挑取，产生明显的透明圈；

4)生理生化特征：该菌株过氧化氢酶、脲酶、MR试验均为阳性，氧化酶、VP试验为阴性，不能产生吲哚，不产生H₂S；可以水解凝胶、吐温-80、三油酸甘油酯、酪蛋白，不能水解淀粉；可以利用葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露醇，不能利用麦芽糖、乳糖、棉籽糖、鼠李糖、丙二酸为碳源。

3.根据权利要求1所述的一种球状芽孢杆菌DS11(Bacillus sphaericusDS11)，所得球状芽孢杆菌DS11(Bacillus sphaericus DS11)菌株在MLB固体平板上可以耐受极性常数不大于2.0的有机溶剂。

4.一种如权利要求1-3中任何一项所述的球状芽孢杆菌DS11(Bacillussphaericus DS11)产有机溶剂稳定性蛋白酶的方法，其特征在于，其步骤如下，将球状芽孢杆菌DS11(Bacillus sphaericus DS11)接种到MLB液体培养基中，180r/min，28℃培养24h，作为种子液；将种子液以1％的接种量接种于产酶发酵培养基，180r/min，28℃培养32h，10,000g离心20min后所得上清液过0.22μm滤膜即得有机溶剂稳定性蛋白酶粗酶液。

5.一种如权利要求4所述的方法所产有机溶剂稳定性蛋白酶，其特征在于，所述的有机溶剂稳定性蛋白酶具有以下性质，向粗酶液中加入25％不同的有机溶剂，30℃，140r/min，14d后，甲醇、乙醇、1-丁醇处理后的剩余酶活分别为原酶活的35％、36％和42％；在苯、二甲苯、己烷、正己烷中保持82％以上的酶活性；正癸烷、辛烷、异辛烷、庚烷可提高了酶的活性。