[发明专利]用于检测烟草根黑腐病菌的引物、探针及实时荧光PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种适合于农业生产、植物保护等部门使用的生物工程技术，特别是一种用于检测烟草生产中的土传病害——烟草根黑腐病病原菌Thielaviopsis basicola的引物、探针及实时荧光PCR试剂盒。

背景技术

烟草根黑腐病是烟草上的重要病害之一，它遍布世界主要产烟区，在美国、加拿大、日本等国曾使烟草生产遭受严重损失，我国主产烟区也均有发生。尤其近年来，此病在一些烟区蔓延，在我国云南、贵州、湖北等省发生较重，严重地块发病率可达30％以上。山东、河南、安徽、吉林、福建等省也有发生，近年有加重危害的趋势。

目前对于植物病原真菌的检测方法主要有免疫学技术，分子标记技术和常规PCR技术，但这些技术只能确定病原微生物的有无，却不能对病原真菌的分生孢子及厚亘孢子数目进行准确的定量。而传统的植物病原真菌检测定量方法是选择性培养基培养计数法，但选择性培养基培养计数周期长，耗费人力，而且需要操作者具有丰富的形态学知识，因而限制了选择性培养基培养计数法的应用。

继常规PCR检测技术之后，新兴的实时荧光定量PCR技术凭借其对初始模板量准确定量、灵敏度高、特异性强、简便迅速等优点，已经成为国内外分子生物学研究中的主流技术，同样也在植物病原体的检测和诊断中得到了广泛使用。近年来国内外陆续开始将实时荧光PCR技术应用于植物病害诊断检测。

实时定量荧光PCR是利用荧光信号伴随着PCR产物的增加而增强的原理，在PCR扩增过程中，连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，在99.7％的置信度时计算出大于平均值的荧光值即阈值，然后收集荧光信号增强到预定阈值时的PCR循环次数(即Ct值)。该参数和PCR反应体系中起始DNA模板量的对数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度稀释标准品的Ct值绘制成标准曲线，再根据检测样品的Ct值就可以准确地测定靶标病原菌的起始模板拷贝数。实时荧光PCR根据其产生荧光的原理分为使用探针和不使用探针的两类方法。由于探针与待检测病原菌DNA序列有很高的特异性，而且可以有效避免常规PCR的假阳性问题，所以目前使用较为普遍的是荧光标记探针法。

实时荧光PCR检测方法用于植物病原菌的检测，在国内外都还是刚刚起步。目前，在烟草根黑腐病菌的实时荧光PCR检测中，以5’-ACC ATA TGT GAA CGT ACC TTTTCT-3’和5’-AGT TTA TAA ATG CTA CCG GCA GAA-3’为引物、以5’-CCC GAG AGG CACCTG CCA AAG CA-3’序列为探针制备成相应的实时荧光PCR试剂盒，尚无相关报道。

发明内容

本发明的目的之一就是提供一种用于检测烟草根黑腐病菌的引物，它可以在PCR检测过程中，定性检测烟草根黑腐病菌，而且特异性强。

本发明所提供用于检测烟草根黑腐病菌的引物包括正向引物Tb1和反向引物Tb2组成的引物对，所述正向引物Tb1的核苷酸序列见序列表中的序列1所示，Tb1：5’-ACC ATA TGTGAA CGT ACC TTT TCT-3’；所述反向引物Tb2核苷酸序列见序列表中的序列2所示，Tb2：5’-AGT TTA TAA ATG CTA CCG GCA GAA-3’。

申请人是经过长期大量的实验，从众多用于检测烟草根黑腐病菌的PCR引物中筛选出上述的由正向引物Tb1和反向引物Tb2组成的引物，其扩增片段大小为76bp。该引物的特点是对烟草根黑腐病菌具有高度的保守性，与其它近缘生物种之间不具有显著的同源性，用该引物进行PCR扩增，实现烟草根黑腐病菌的准确定性检测，且特异性强。

本发明的目的之二就是提供一种用于检测烟草根黑腐病菌的探针，它可以在实时荧光PCR检测过程中，定量检测烟草根黑腐病菌，显著地提高检测灵敏度。该探针的碱基序列是在5’-CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA-3’两端向上移位2个碱基或下游移位3个碱基区域内的任意一条核苷酸序列，所述探针一端连接有荧光淬灭基团，另一端连接有荧光报告基团。

所述探针荧光报告基团标记在5’端，荧光淬灭基团标记在3’端，构成荧光标记探针。

所述探针是在5’-CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA-3’向上游移位2个碱基的核苷酸序列5’-GCC CCG AGA GGC ACC TGC CAA AGC A-3’，见序列表中的序列4所示。