[发明专利]微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺

说明书

一、技术领域：

本发明涉及一种碱性蛋白酶的生产工艺，尤其是涉及一种微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺。

二、背景技术：

随着化学农药产品的种类和产量的增加，其施用范围也不断扩大，农药残留已对人类和生态环境造成严重的威胁，而生物农药由于其高效、安全、无毒、无残留、无环境污染的优点，已成为农业发展中最为活跃的研究领域。近十多年来，由于各国的重视，生物农药研究和生产都有了很大的发展，目前化学农药每年以2％的速度递减，而生物农药却以5％的速度递增。特别是我国作为农业大国，在2001年加入WTO后面对着国际市场上激烈的竞争，微生物资源在农业上的开发和利用也迎来了前所未有的历史机遇和挑战，其发展将有利于解决当前农业生态环境中的难点问题。为了保护生态环境和实现农业的可持续性发展，开发出具有自主知识产权的微生物农药显得意义深远，且具有广阔的市场价值和应用前景。

微生物杀虫剂具有无污染、无残留和对人体危害小等特点，但也存在作用时间长、侵染力弱、杀虫效果迟缓等缺点。而许多细菌能够分泌碱性蛋白酶，降解昆虫寄主的表皮蛋白质，协助菌体侵入虫体，提高杀虫剂的毒力，克服生物杀虫剂迟效和不稳定的缺点。因此可在生物杀虫剂中添加碱性蛋白酶，开发出高效的生物农药。同时碱性蛋白酶还在医学上作为生化药物，在食品工业中作为嫩化剂、沉淀剂等广泛使用，甚至在日用品工业中用作美容产品添加剂。

目前，国内外大多利用动物胰脏来提取生产，成本高，产量有限，限制了该酶的应用范围。而采用微生物发酵生产碱性蛋白酶周期短、营养需求低、提取工艺简单，可实现自动化生产，不受原料限制而进行大规模生产，对国家的可持续发展策略具有深远的意义。

三、发明内容：

本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺，其采用微生物发酵生产碱性蛋白酶，周期短，营养需求低，提取工艺简单，降低了成本，同时提高了蛋白酶的回收率。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺，其特征在于包括以下步骤：

(1)菌种培养：采用种子培养基对枯草芽孢杆菌种进行扩大培养；

(2)发酵培养基配制；

(3)发酵：将枯草芽孢杆菌菌种接入摇瓶，进行发酵得发酵液；

(4)粗提：发酵液经预处理后离心，脱色，过滤和减压干燥得粗品碱性蛋白酶；

(5)精制：粗品经纯化溶解后，盐析，透析，超滤浓缩，凝胶过滤层析，然后干燥浓缩得成品。

步骤(1)中发酵培养基的配方为：葡萄糖1.2％+蔗糖0.6％+淀粉1.2％，豆饼粉3.0％，酵母粉0.3％，K2HPO4·3H2O0.2％，其余以蒸馏水补充。

步骤(3)中发酵条件为发酵时间36h，温度36℃，初始最佳PH值8.0，摇瓶转速150r/min。

步骤(3)中枯草芽孢杆菌的培养方法为：

(1)：菌种培养基选用：采用LB液体培养基：

胰化蛋白胨10g/L+酵母提取物5g/L+NaCl5g/L+蒸馏水

(2)：将配置好的LB培养基调节PH至7.8，分装三角瓶，在0.105Mpa蒸汽压力灭菌30min，自然冷却至45℃，24h后无菌条件下接种枯草芽孢杆菌菌种，38℃下170r/min摇床培养36-38h；

(3)：无菌条件下将扩大培养的菌液接入发酵培养基。

在发酵液中加入植物油作为消泡剂，加入量为0.3％(w/w)

发酵液的处理和产品制备过程为：

(1)发酵液的预处理：

取发酵完毕的发酵液100ml，加入絮凝剂NaAlO2，室温搅拌8min后静置待分层；絮凝剂NaAlO2的用量以质量百分数0.1％—0.15％为宜；

(2)离心：

将预处理后的发酵液的上清液装入离心管，在4℃条件下8000r/min离心8min；

(3)脱色：

向离心液中加入1％的中颗粒活性炭，用水浴加热至90℃，保温搅拌30分钟，趁热过滤，如滤液颜色加重，可用活性炭再度脱色，直至滤液为无色或微黄色为止；

(5)纸板过滤：过滤纸板由孔径30～50μm的棉花纤维、石棉和硅藻土组成，纸板过滤机的压力为0.3MPa，取滤液低温干燥可得粗蛋白酶；

(6)盐析：