[发明专利]微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺

权利要求书

1.一种微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺，其特征在于包括以下步骤：

(1)菌种培养：采用种子培养基对枯草芽孢杆菌种进行扩大培养；

(2)发酵培养基配制；

(3)发酵：将枯草芽孢杆菌菌种接入摇瓶，进行发酵得发酵液；

(4)粗提：发酵液经预处理后离心，脱色，过滤和减压干燥得粗品碱性蛋白酶；

(5)精制：粗品经纯化溶解后，盐析，透析，超滤浓缩，凝胶过滤层析，然后干燥浓缩得成品；

所述的步骤(2)中发酵培养基的配方为：葡萄糖1.2％，蔗糖0.6％，淀粉1.2％，豆饼粉3％，酵母粉0.3％，K₂HPO₄·3H₂O 0.2％，其余以蒸馏水补充，其中百分比为w/w；

所述的步骤(3)中发酵条件为发酵时间36h，温度36℃，初始PH值8.0，摇瓶转速150r/min；

所述的步骤(3)中枯草芽孢杆菌的培养方法为：

①：菌种培养基选用：采用LB液体培养基；

②：将配置好的LB培养基调节PH至7.8，分装三角瓶，在0.105Mpa蒸汽压力灭菌30min，自然冷却至45℃，24h后无菌条件下接种枯草芽孢杆菌菌种，38℃下170r/min摇床培养36-38h；

③：无菌条件下将扩大培养的菌液接入发酵培养基；

在发酵液中加入植物油作为消泡剂，加入量为0.3％ w/w；

发酵液的粗提和精制过程为：

①发酵液的预处理：

取发酵完毕的发酵液100ml，加入絮凝剂NaAlO₂，室温搅拌8min后静置待分层；絮凝剂NaAlO₂的用量为质量百分数0.1％-0.15％；

②离心：

将预处理后的发酵液的上清液装入离心管，在4℃条件下8000r/min离心8min；

③脱色：

向离心液中加入1％的中颗粒活性炭，用水浴加热至90℃，保温搅拌30分钟，趁热过滤，如滤液颜色加重，可用活性炭再度脱色，直至滤液为无色或微黄色为止；

④纸板过滤：过滤纸板由孔径30～50μm的棉花纤维、石棉和硅藻土组成，纸板过滤机的压力为0.3MPa，取滤液低温干燥可得粗蛋白酶；

⑤盐析：

将硫酸铵晶体磨成粉末，在冰浴条件下边搅拌边加入PH为7.8的粗蛋白酶溶液中，然后继续搅拌1h放置于4℃条件下4000r/min离心30min，收集沉淀，溶于定量缓冲液中；

⑥透析：

将盐析获得的沉淀物溶解于装有0.2mol/L PH 7.4硼酸缓冲液中的透析袋中，扎好两端，置于10倍酶液体积的蒸馏水中4℃透析过夜，其间需换水4次，最后以饱和BaCL₂来检测硫酸铵是否透析完全；

⑦超滤：

将透析所得酶液置于超滤容器中在4℃的环境中，在氮气压力0.5个大气压力下，用截留分子量为10万的膜超滤5h，收集截留的液体；

⑧离子交换柱层析：

选用阴离子交换树脂DEAE-SephadexA50作为填充介质，将DEAE-SephadexA50用蒸馏水充分溶胀，采用浮选法除去过细的粒子，放置一定时间后，倒去上清液，至上清液不含细粒为止；用0.1mol/L HCL浸泡20min，再用0.1mol/L NaOH浸泡20min，最后用0.1mol/L HCL浸泡20min；用上柱缓冲夜平衡几次，抽真空，然后采用快速装柱法装入树脂，避免产生气泡；用洗脱液平衡若干天；洗脱液为50mmol/L，pH 7.4的Tris-HCL缓冲液，洗脱速度为2.8ml/10min，每十分钟收集一管；收集蛋白酶活性峰，浓缩；

⑨SephadexG一75凝胶柱层析：

在低温4℃的环境下，选择SephadexG一75作为填充介质；称取一定量的SephadexG一75在沸水中充分溶胀，冷却，装柱；将DEAE-Sephadex A50收集到的活性峰浓缩后上样；用0.1mol/L PH 7.4的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，洗脱速度为0.5ml/min，用核酸/蛋白检测仪检测，收集含碱性蛋白酶活性组分，然后冷冻干燥浓缩于4℃保存。