[发明专利]一种生物类黄酮色素

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种生物类黄酮在观赏植物中的表达。

背景技术

类黄酮类色素是一类液泡包素，主要存在液泡中，类黄酮的不同色素在液泡中的积累产生了各种花色，同时色素的组成和浓度的不同也是出现各种花色的原因。其中花色素和花色素苷是重要的颜色决定物质，也是花色生理水平的重要检测指标。而类黄酮一3’5’一羟化酶(F3’5’H)是合成3’一，5’一带羟基的花色素的关键酶和限速酶，F3’，5’H基因属于细胞色素450单加氧酶(P450)超家族。细胞色素450单加氧酶(P450)是血红素依赖的氧化酶，广泛分布与各种生物中，具有非常复杂的功能，可以催化成千上万的反应。在植物界分布也非常的广泛，可以催化的反应超过50种，也涉及到类黄酮的合成。它在二氢黄酮醇的3’和5’位置选择性的加入羟基，产生不同的花色素苷从而使得植物显现出不同的颜色。这类色素呈现蓝紫色，是蓝花和紫花形成的原因。因此关于它的研究就成为花色研究领域中重要的一个组成部分。

发明内容

本发明的目的在于提出一种从观赏植物中克隆出的生物类黄酮。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案，本发明的生物克隆具体操作步骤为：

1、蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrida)材料采自上海农业科学院蔬菜园艺研究所，品种为Formosa rosa，花色为紫色，白色，黄色；植物材料在温室正常条件下生长(L/D，16h/8h；25一28℃)。

2、RNA提取：取100毫克左右新鲜的材料，液氮充分研磨。加1mLTriBlue试剂，用力摇15s，室温放置5min。加0.2mL氯仿，去蛋白，上清转移至新的离心管，加等体积异丙醇，充分混匀，室温放置10min。用DEPC配制的75％乙醇1mL洗涤沉淀，重复一次。室温干燥5一10min，溶于20μL DEPC水中，测0D值，电泳检测。

3、基因的克隆：通过对已发表的F3’5’H基因序列进行同源性比较，根据保守区设计兼并引物F和R，进行RT一PCR。

4、巢式PCR扩增：由于基因片段过大，上述步骤无法获得完全基因序列，以3’RACE获得F3’5’H基因的3’端；提取总RNA，逆转录为cDNA；依次使用多轮引物包括AP，AUAP，3GSPI，3GSP2，3GSP3，3GSP4进行巢式PCR扩增。

5、5’端及其上游序列以IPCR方法获得：将基因组DNA以市售的XbaI、XhoI和SphI三种酶进行酶切；再酶切产物自连，以反式PCR扩增；进行三轮扩增反应，每一轮均使用前一轮的产物作为模版；最后得到的特异PCR特异产物连接到pGEM一T载体，克隆、测序。使用的引物包括5一l^a，5一2，5一3，5一4，5一5，5一6，5一7，5一8，3一l^b，3一2，3一3。

本发明的有益效果

F3’，5’H基因属于细胞色素450单加氧酶(P450)超家族。细胞色素450单加氧酶(P450)是血红素依赖的氧化酶，广泛分布与各种生物中，具有非常复杂的功能，可以催化成千上万的反应。在植物界分布也非常的广泛，可以催化反应超过50种，也涉及到类黄酮的合成。它在二氢黄酮醇的3’和5’位置选择性的加入轻基，产生不同的花色素营从而使得植物显现出不同的颜色。

具体实施方式：

下面结合具体实施实例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如Sambrook等分子克隆：实验手册(New York：ColdSpring Harbor Labortary PreSS，1989)中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。

实施例1

本发明的生物克隆具体操作步骤为：

1、蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrida)材料采自上海农业科学院蔬菜园艺研究所，品种为Formosa rosa，花色为紫色，白色，黄色。植物材料在温室正常条件下生长(L/D，16h/8h；25一28℃)。

2、RNA提取。取100毫克左右新鲜的材料，液氮充分研磨。加1mLTriBlue试剂，用力摇15s，室温放置5min。加0.2mL氯仿，去蛋白，上清转移至新的离心管，加等体积异丙醇，充分混匀，室温放置10min。用DEPC配制的75％乙醇lmL洗涤沉淀，重复一次。室温干燥5一10min，溶于20μL DEPC水中，测0D值，电泳检测。