[发明专利]一种生物类黄酮色素

权利要求书

1.一种生物类黄酮色素，其特征在于，本发明的生物克隆具体操作步骤为：

(1)蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrida)材料采自上海农业科学院蔬菜园艺研究所，品种为Formosa rosa，花色为紫色，白色，黄色；植物材料在温室正常条件下生长(L/D，16h/8h；25一28℃)。

(2)RNA提取：取100毫克左右新鲜的材料，液氮充分研磨。加1mLTriBlue试剂，用力摇15s，室温放置5min。加0.2mL氯仿，去蛋白，上清转移至新的离心管，加等体积异丙醇，充分混匀，室温放置10min。用DEPC配制的75％乙醇1mL洗涤沉淀，重复一次。室温干燥5一10min，溶于20μL DEPC水中，测0D值，电泳检测。

(3)基因的克隆：通过对已发表的F3′5′H基因序列进行同源性比较，根据保守区设计兼并引物F和R，进行RT一PCR。

(4)巢式PCR扩增：由于基因片段过大，上述步骤无法获得完全基因序列，以3′RACE获得F3′5′H基因的3’端；提取总RNA，逆转录为cDNA；依次使用多轮引物包括AP，AUAP，3GSPI，3GSP2，3GSP3，3GSP4进行巢式PCR扩增。

(5)5’端及其上游序列以IPCR方法获得：将基因组DNA以市售的XbaI、XhoI和SphI三种酶进行酶切；再酶切产物自连，以反式PCR扩增；进行三轮扩增反应，每一轮均使用前一轮的产物作为模版；最后得到的特异PCR特异产物连接到pGEM一T载体，克隆、测序。