[发明专利]荧光定量型生物条形码检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的检测方法及其应用，特别是涉及一种新型的荧光定 量型生物条形码检测方法及其在生物检测中的应用。

背景技术

生物条形码检测技术(bio-bar codes assay，BCA)是美国西北大学Mirkin教 授领导的课题组于2003年首次报道的一种新型标记免疫测定技术，其突出特点是具 有极高的灵敏度，可达常规ELISA方法的10⁶倍(Nam JM，Thaxton CS，Mirkin CA. Nanoparticle-based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins. Science，2003，301(5641)：1884-1886)。

BCA技术的基本原理是利用被检物单抗标记的磁性微球探针(magnetic microparticles，MMPs)和被检物多抗及特异DNA双链标记的金纳米颗粒探针 (nanoparticle，NP)，通过形成MMP-被检物-NP三明治复合物后再利用去杂交将NP 探针上标记的特异DNA链释放出来，再通过常规PCR方法或芯片检测方法(金标银染 法)鉴定这些释放的DNA链就可确定被检物的存在。

利用生物条形码技术检测PSA的方法为：纳米颗粒探针(nanoparticle探针，NP) 即是金纳米颗粒包被有双链DNA和抗PSA的多克隆抗体，双链DNA的其中一条和胶体金 颗粒通过Au-S键相连，另一条和前者互补是用来指示被检物的条形码DNA，每一个直 径为30nm的胶体金上大约标记有400条左右的条形码DNA链(Hurst SJ，Lytton-Jean AR， Mirkin CA.Maximizing DNA loading on a range of gold nanoparticle sizes.Anal. Chem.2006，78：8313-8318)，磁性微球探针(magnetic microparticle探针，MMP) 即是对应于分选磁场的直径约为1μm的磁珠微球，其表面上包被有抗PSA的单克隆抗 体。

从BCA技术的检测程序可以看出，其基本原理几乎等同于ELISA检测中双抗体夹 心法高度特异地捕获抗原(被检物)，通过检测条形码DNA而实现对被检物的间接检 测，由于PCR反应和芯片检测的放大效应，使检测灵敏度得到极大提高。

1.生物条形码的检测过程可以分为条形码DNA的获取和条形码DNA的检测两大方面。 条形码DNA的获取过程包括三步，第一步：抗原抗体作用先用抗被检物的单抗功能 化的MMP探针特异性地结合标本中可能的被检物，加上磁场固定MMP探针，用PBS溶液 反复冲洗，除去未连结的被检物和不相关的杂质；第二步：洗脱和去杂交加入被双 链DNA和抗被检物的多抗修饰的NP探针，将被检物夹在中间，形成一个三明治结构， 接着加上磁场，用磁铁固定MMP探针的同时，反复冲洗，除去未连接的NP探针；第三 步：DNA分离此步是一个去杂交步骤，三明治结构被磁场固定，在高温低盐条件下， NP探针上结合的数以百计的条形码DNA释放到溶液中，接着对条形码DNA链进行定量， 从而间接检测被检物。条形码DNA链的检测现在有两种方式：一是对获取的条形码DNA 链作普通的PCR扩增，然后凝胶电泳检测；二是通过芯片检测，芯片检测系统需要三 种不同作用的核酸：1)与固相支持物(玻片等)连接的捕获探针(捕获DNA修饰的玻 片)；2)产生信号的检测探针(DNA修饰的胶体金)；3)靶核酸(条形码DNA)，靶 核酸在这个体系中起连接捕获探针和信号检测探针的作用。如体系中存在上述三种成 分，靶核酸能与上述两种核苷酸杂交，洗脱去除杂质后能得到一个清晰的检测信号， 如果靶核酸不与上述两种探针杂交，则信号探针无法连接在固相物上，洗脱后固相物 上无信号应答，得到的信号可以用普通的平板扫描仪进行分析(Georganopoulou DG， Chang L，Nam JM，et al.Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer’s disease.Proc Natl Acad Sci， 2005，102(7)：2273-2276)。