[发明专利]母系遗传耳聋线粒体基因1494位C-T和1555位A-G突变的检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及基因工程技术领域，具体讲是涉及母系遗传耳聋线粒体基因 1494位C—T突变和1555位A—G突变的检测方法。本发明还涉及制备根据该 方法的体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1494位C—T突变和1555位A—G突 变的试剂盒，以及该试剂盒在检测所述的1494位C—T突变和1555位A—G突 变中的应用。

背景技术：

氨基糖甙类抗生素(链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素及小诺霉素 等)因其广谱高效的抗菌作用以及低廉的价格在临床上被广泛用于控制革兰氏 阴性和阳性菌感染，但此类抗生素具有严重的耳毒性作用，可使患者发生不可 逆转的听力损失。近十年来研究发现，部分氨基糖甙类抗生素致聋患者有母系 遗传家族史，并与线粒体DNA12S rRNA基因1494C—T和1555A—G均质性点 突变有关。单次剂量的氨基糖甙类药物应用即可导致携带1494C—T或1555A— G突变个体的重度听力损失。根据目前已有的研究结果可知，几乎携带1494C —T或1555A—G突变的个体在应用不同剂量的氨基糖甙类抗生素后均可发生 严重或者较严重的听力损失，是后天性获得性耳聋发生的重要原因。鉴于这一 耳聋的有明确的基因变化和诱发因素，使得这种耳聋成为一种可以预防的疾病。

1555位A—G突变和1494位C—T突变会在12S rRNA的高度保守的A位 形成新的1494C-G1555或1494U-A1555碱基对。这些改变使得12S rRNA在二 级结构上与细菌的16S rRNA的相应区域的二级结构更加相似，因此，由于1494C —T和1555A—G突变在12S rRNA形成U-A和G-C配对使线粒体与氨基糖甙 类抗生素的结合更加容易，所以带有这些突变的人在接触了氨基糖甙类抗生素 时会出现或加重耳聋。

线粒体DNA1555位A—G突变较为为常见，发生率约为1～3％ (Mkaouar-Rebai E等，Biochem Biophys Res Commun2006，340：1251-1258； OStergaard E等，Clin Genet2002，62：303-305；Usami S等，J Med Genet2000， 37：38-40)，而线粒体DNA1494位C—T突变在中国耳聋人群中的发生频率为 0.45％(李琦等，中国听力言语康复科学杂志，2008)，考虑到尚有很多同类家系 尚未被发现报道，以及1494C—T和1555A—G突变在散发性耳聋的致病机制中 占有一定的比例，对这种耳聋的预防变得更为重要，其预防的关键环节在于通 过筛查，检测发现携带线粒体1494C—T和1555A—G突变的个体，绝对禁止此 类个体接触氨基糖甙类抗生素，从而避免严重的耳毒性反应发生。

自1993年以来，对此突变的检测除了直接测序外，最常用的筛选方法为 BsmA I(Alw261)酶切法(Fischel-Ghodsi等，Am J Otolaryngol，1993，14：399-403； Fischel-Ghodsian等，Am J Otolaryngol，1997b，18：173-178；袁慧军等，中华耳鼻 咽喉科杂志，1998，33：67-70)。在国内外，普遍应用限制性酶BsmAI(Alw261) 酶切配合序列分析鉴定有无线粒体DNA1555A—G突变，酶切鉴定方便快捷， 结果可靠，但不足的是BsmA I(Alw261)价格较贵，与常用的限制性酶相比，价 格差异达50～100倍。

专利号为ZL03156762.2的专利公开了一种线粒体1555位A—G突变的检测 方法及试剂盒，此专利通过在线粒体DNA的1555位邻近引入一个包括1555 位在内的新的限制性酶位点，然后用相应的限制性酶消化，从而检测该突变的 存在。此方法简单快捷而且成本低，但不能达到快速、准确、成本低并且同时 检测1494C—T和1555A—G两个突变的要求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术中检测线粒体DNA的1494位C —T突变和1555A—G突变的方法所存在的缺陷，提供一种简单、快速、成本低 并且同时检测两个突变位点的方法。

本发明要解决的另一个的技术问题是提供一种根据上述方法的体外检测母 系遗传耳聋线粒体基因1494位C—T突变和1555位A—G突变的试剂盒。

本发明要解决的再一个技术问题是该试剂盒在检测所述的1494位C—T突 变和1555位A—G突变中的应用。