[发明专利]一种抑制素基因工程调控抗原的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于动物生产性状调控物质技术领域，特别涉及一种抑制素基因工程调控抗原的制备方法。

背景技术

目前的畜牧业在集约化和产业化发展过程中，由于在遗传育种技术、饲料配合技术、疫病防治技术、环境卫生技术和现代企业经营管理技术的应用，使畜牧业的生产效率得到了极大的提高。但各生产环节中，动物的繁殖性能在过去几十年却没有提高。在家畜中除猪外，绝大部分的牛和羊等动物在发情时仅排一枚卵而只能产一仔，在生产一头肉用动物的同时必须同时供养一头种母畜，致使肉牛业和肉羊业的生产成本居高不下，生产效率和经济效益的提高受到极度限制。目前，如何提高产仔数和得到更多的优良胚胎一直是畜牧生产和畜牧研究所追求的目标。

产仔数少和在胚胎移植过程中得到可利用胚胎少是由于卵泡分泌的卵泡抑制素，抑制垂体分泌FSH，小卵泡不能正常生长，在自然条件下卵巢只能排出一个卵子，牛羊出现单胎。而在超排时也由于大剂量的注射FSH导致排出的卵利用率很低。

目前用于提高产仔数和得到更多的优良胚胎的方法可以通过两种方法：使用药物和内分泌免疫调控。使用常规药物是家畜注射FSH或FSH类似的药物，拮抗抑制素发挥作用，根据目前的结果：在超排过程中得到的胚胎利用率很低，已经没有发掘的潜力。而通过内分泌免疫调控则可以获得更多的可利用胚胎，在动物的卵泡发育过程中，卵泡颗粒细胞在未表达FSH受体之前对FSH无反应，其分裂增殖和功能发育受到卵泡分泌的另一旁分泌因子活化素(Activin)的促进。活化素具有促进FSH分泌的作用，同时也是抑制素拮抗的激素。在免疫抑制素促进垂体分泌FSH的同时，也将解除抑制素对卵泡颗粒细胞表面活化素受体的拮抗作用，从而促进小卵泡发育使其表面具有FSH受体并成为对FSH具有反应的卵泡。因此在免疫抑制素的基础再使用FSH进行超数排卵，这些原本未能发育的卵泡也将能够继续发育出来，并最后成熟排卵，在母畜配种后产生比普通的超排处理更多的胚胎。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种成本低、工艺简单的抑制素基因工程调控抗原的制备方法，所述抑制素基因工程调控抗原用于提高动物排卵数、产仔数和胚胎产量。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

提供一种抑制素基因工程调控抗原的制备方法，包括下述步骤：

(1)克隆抑制素编码基因；

(2)利用抑制素编码基因，制备抑制素的重组融合蛋白；

(3)利用该抑制素重组融合蛋白制备抑制素的基因工程调控抗原。

步骤(1)所述克隆抑制素编码基因包括以下步骤：

(a)根据Genbank中发表的猪抑制素亚基基因序列(Genbank号：NM_214189)，设计特异性上游引物I1和下游引物I2；

(b)采取异硫氰酸胍-氯仿-异丙醇方法从蓝塘猪卵巢组织中提取总基因组RNA，通过反转录得到cDNA；

可取蓝塘猪卵巢组织，置于1ml异硫氰酸胍苯酚溶液(Trizol液，购于Invitrogen公司)中匀浆，然后用氯仿去除蛋白质，离心15分钟后取出上清液，向上清液中加入异丙醇再离心沉淀总基因组RNA。把总RNA配成1g/L的浓度溶于含DEPC的水中，通过反转录(RT)得到cDNA。

(c)用引物I1、I2、dNTP和反转录合成cDNA作为模板，在DNA聚合酶的催化下通过PCR反应扩增得到一条长度为1095bp的特异性条带，即猪抑制素的编码cDNA片段。

步骤(a)所述上游引物I1和下游引物I2为：

I1：5’-ATGTGGCCTCAGCTGCTCCTCTTGC-3’；

I2：5’-TTAGATGCAGGCACAGTGCTGGGTG-3’。

步骤(2)所述制备抑制素的重组融合蛋白是指利用IPTG诱导大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株表达制备重组融合蛋白；包括以下步骤：

(d)根据抑制素成熟肽的cDNA碱基序列和大肠杆菌表达质粒pRSET A的多克隆位点碱基序列，设计合成上游引物Mf和下游引物Mr；

(e)利用所述引物Mf、Mr以及上述反转录扩增得到的抑制素的编码cDNA序列为模板，通过PCR反应扩增出抑制素成熟肽的cDNA克隆片段；

(f)所述抑制素成熟肽的cDNA克隆片段经过Bgl II和EcoR I双酶切后，克隆到表达质粒pRSET A的Bgl II和EcoRI两酶切位点之间，构建成重组表达质粒pInhibin SCAU；