[发明专利]一种抑制素基因工程调控抗原的制备方法

权利要求书

1、一种抑制素基因工程调控抗原的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)克隆抑制素编码基因；

(2)利用抑制素编码基因，制备抑制素的重组融合蛋白；

(3)利用该抑制素重组融合蛋白制备抑制素的基因工程调控抗原。

2、根据权利要求1所述的抑制素基因工程调控抗原的制备方法，其特征在于步骤(1)所述克隆抑制素编码基因包括以下步骤：

(a)根据现有的抑制素基因序列，设计特异性上游引物I1和下游引物I2；

(b)采取异硫氰酸胍-氯仿-异丙醇方法从蓝塘猪卵巢组织中提取总基因组RNA，通过反转录得到cDNA；

(c)用引物I1、I2、dNTP和反转录合成cDNA作为模板，在DNA聚合酶的催化下通过PCR反应扩增猪抑制素的编码cDNA片段。

3、根据权利要求2所述的抑制素基因工程调控抗原的制备方法，其特征在于步骤(a)所述上游引物I1和下游引物I2为：

I1：5’-ATGTGGCCTCAGCTGCTCCTCTTGC-3’；

I2：5’-TTAGATGCAGGCACAGTGCTGGGTG-3’。

4、根据权利要求1所述的抑制素基因工程调控抗原的制备方法，其特征在于步骤(2)所述制备抑制素的重组融合蛋白是指利用IPTG诱导大肠杆菌株表达制备重组融合蛋白；包括以下步骤：

(d)根据抑制素成熟肽的cDNA碱基序列和大肠杆菌表达质粒pRSET A的多克隆位点碱基序列，设计合成上游引物Mf和下游引物Mr；

(e)利用所述引物Mf、Mr以及上述反转录扩增得到的抑制素的编码cDNA序列为模板，通过PCR反应扩增出抑制素成熟肽的cDNA克隆片段；

(f)所述抑制素成熟肽的cDNA克隆片段经过Bgl II和EcoR I双酶切后，克隆到表达质粒pRSET A的Bgl II和EcoR I两酶切位点之间，构建成重组表达质粒pInhibin SCAU；

(g)将所述重组表达质粒pInhibin SCAU转化到大肠杆菌株，在培养液中加入0.05mmol/L～0.2mmol/L的IPTG诱导，得到重组细菌表达的抑制素重组融合蛋白。

5、根据权利要求4所述的抑制素基因工程调控抗原的制备方法，其特征在于步骤(d)所述上游引物Mf和下游引物Mr为：

Mf：5’-AATAGATCTTCTCCACCGCCCCTCTGCCC-3’，其中方框部分为Bgl II限制性酶切位点，画线部分是维持阅读框架的碱基；

Mr：5’-ATCGAATTCAGATGCAGGCACAGTGCTGGG-3’，其中方框部分为EcoR I限制性酶切位点。

6、根据权利要求4所述的抑制素基因工程调控抗原的制备方法，其特征在于步骤(g)所述诱导时间为4～6小时。

7、根据权利要求4所述的抑制素基因工程调控抗原的制备方法，其特征在于还包括所述抑制素重组融合蛋白的纯化步骤。

8、根据权利要求7所述的抑制素基因工程调控抗原的制备方法，其特征在于所述纯化是用6～8Mol尿素裂解表达抑制素重组融合蛋白的大肠杆菌；采用Ni-NTA凝胶纯化树脂对含有抑制素重组融合蛋白的溶液进行层析；洗脱纯化得到抑制素重组融合蛋白。

9、根据权利要求1所述的抑制素基因工程调控抗原的制备方法，其特征在于步骤(3)所述利用抑制素重组融合蛋白制备抑制素的基因工程调控抗原包括以下步骤：

(h)将浓度为2～6mg/mL的抑制素重组融合蛋白溶于含2～4％吐温-80的水溶液中制成水相；

(i)将10号轻质白油和司本80混合，再加入硬脂酸铝，混合均匀制成油相；

(j)将水相和油相混合，并搅拌制成油包水的均质乳液，即得抑制素基因工程调控抗原。

10、根据权利要求9所述的抑制素基因工程调控抗原的制备方法，其特征在于步骤(i)所述10号轻质白油和司本80的体积比为94％：6％，所述硬脂酸铝的浓度为2％；步骤(j)所述水相和油相的体积比为4～5：5～6。