[发明专利]腺病毒转染的初级细胞以及路径图谱绘制方法

说明书

本申请是申请日为2004年12月01日、发明创造名称为“腺病毒转染 的初级细胞以及路径图谱绘制方法”的中国专利申请200480034585.3 (PCT/US2004/040054)的分案申请。

发明背景

发明领域

本发明涉及路径图谱绘制领域，特别是非永生细胞系免疫细胞的路径 图谱绘制。本发明还涉及调控胞内信号传递路径表达的领域。

相关领域的说明

胞内信号传递路径是这样的一组基因，其表达受到由初始刺激起始的 基因到基因的相互作用级联的控制。换言之，胞内信号传递路径的初始刺 激直接地或者通过路径中的另一基因间接地控制该路径中每一个基因的表 达。已知的信号传递路径参与包括免疫应答、发育、有丝分裂和炎症等在 内的广泛的生物活动，而且包括但不限于：促分裂原活化蛋白激酶 (“MAPK”)路径，蛋白激酶A(“PKA”)信号传递路径，蛋白激酶C (“PKC”)信号传递路径，I型干扰素信号传递路径，钙调磷酸酶(“CaN”) 信号传递路径，κB细胞顺式作用核因子(“NFκB”)信号传递路径以及 IκB激酶(“IKK”)信号传递路径。尽管在广泛的疾病状态中都牵涉到信 号传递路径缺陷，但在许多情况下，我们对于初始刺激和最终的细胞应答 之间的信号传递路径知之甚少。

路径图谱绘制通常是指阐明路径初始刺激和最终应答之间的步骤。就 本发明来说，“路径图谱绘制”是指确定候选顺式作用调节元件是否直接 或间接地受给定信号传递路径的控制。已知的路径图谱绘制方法采用来自 培养的细胞系的宿主细胞，该宿主细胞已用含有有效地连接于待测调节元 件的报告基因的DNA质粒转染。本领域已很好地确立了报告基因的使用。 参见Kain，SR和Ganguly，S，《最新分子生物学实验方法汇编》中第9.6 单元的“基因报告系统综述”(Overview of Genetic Reporter Systems，Unit 9.6 in Current Protocols in Molecular Biology)，编辑Ausubel，FM等人 (Wiley and Sons，NY，1995)。

转染是指将外来DNA导入宿主细胞如培养的哺乳动物细胞中。已证 明转染是分析基因及其相关基因产物的功能、调节和相互作用的强有力工 具。本领域已经很好地确立了转染细胞的操作。化学和物理转染方法包括 DEAEdextran(Fox RM等人，《生物化学》(Biochemistry)10月4日； 16(20)：4470-7，PMID 911769(1977))，磷酸钙(Pear，W.S.，Nolan，G.P.， Scott，M.L.，& Baltimore，D.《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad. Sci.USA)90，8392(1993))，脂质体介导的转染(Zhang WW等人，《生物 技术》(Biotechniques)11月；15(5)：868-72(1993))，微注射 (Colbere-Garapin F和Garapin AC，《发育生物学标准》(Dev Biol Stand)； 55：267-71，PMID：6329857(1983))以及电穿孔(Neumann E和Kakorin S， 《癌症研究和治疗技术》(Technol Cancer Res Treat.)10月； 1(5)：329-40(2002))。本领域也已很好地确立了重组腺病毒载体在转染中的 用途。参见Berkner，KL和Sharp，PA《核酸研究》(Nucelic Acids Res.) 11：6003-6020(1983)；Berkner，KL和Sharp，PA《生物技术》 (BioTechniques)6：616-629(1988)；Bett，AJ，Haddara，W，Prevec，L和 Graham，FL《美国国家科学院院报》(PNAS)USA 91：8802-8806(1994)； Hitt，M，Addison，CL和Graham，FL《药理学进展》(Adv.Pharmacol.) 40：137-206(1997)。其中，重组腺病毒业已被用来转染心脏组织(Ardehali， A.J.Thor.Cardiovas.Surg.111：246-252(1996))和淋巴细胞(Leon，RP， Hedlund，T，Meech，SJ，Li，S，Schaack，J，Hunger，SP，Duke，RC和 DeGregori，J《美国国家科学院院报》(PNAS)USA 95：13159-13164 (1998))。人类腺病毒系双链DNA病毒，其通过受体介导的内吞作用而进 入细胞。这些病毒由于易于培养和操作且显示出广泛的体内体外宿主范围 而被认为非常适合用于基因转移。腺病毒能够感染静止的以及复制中的靶 细胞，并持续存在于染色体之外，而不是整合到宿主染色体组中。重组腺 病毒能够容纳相对较大的外来DNA片段(大约7kb)，并具备高滴度病毒 产量的优点。