[发明专利]一种体外检测精子存活率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种体外检测精子存活量的方法，换言之是一种检测精子质膜损伤情况的新方法。

背景技术

目前，评价精子质膜完整性的主要方法有常规染色法、低渗膨胀试验(hypoosmotic swelling test，HOST)和荧光分子探针染色法。常规染色法至今还是国内临床男科实验室的常用方法，主要有伊红染色、伊红-苯胺黑(eosin-nigrosin stain)、台盼蓝(typan blue stain)染色以及伊红-苯胺黑-吉姆萨染色法等。这些方法操作要复杂，而且高估了死精子的比例，更重要的是不同的实验室之间，检测结果差异较大。

低渗膨胀试验由Jeyendran等于1984年报道，当精子处于低渗溶液中时，质膜外的水分子进入精子以达到细胞内外的渗透压平衡，这时精子尾部发生膨胀弯曲，说明精子质膜是完整的。这种方法廉价简单，但是准确性低，主观性强，只能用于粗略评价精子质膜完整性。

近年来利用能区分死活精子及非细胞成分的荧光探针染色方法，不仅具有简便、快速且准确的特点，而且一些荧光探针在一定时间内对细胞没有损伤作用，对精子的活率没有明显影响，在同一个视野中，既能观察精子的活率，又能获得存活率的结果，因此结果更一致。

目前市售的精子存活率荧光染色试剂盒只有Invitrogen公司推出的LIVE/DEAD Sperm Viability Kit，该试剂盒主要包括两个荧光探针SYBR-14和碘化丙锭(propidium iodide，PI)。PI是常规的死细胞特异性荧光探针，而SYBR-14具有膜通透性，因此死、活精子均着色。在荧光显微镜下，着绿色荧光的是活精子，红色荧光的是死精子。计算得到的精子存活率(viability)就反映了质膜完整的精子所占的比例。由于该试剂盒价格昂贵，因此荧光染色法没有在国内临床男科实验室普及。

通过荧光显微镜下人工计数红、绿精子比例的方法评价质膜完整性，受到主观因素的影响，且受视野所限，只能检测每份样品中极少量精子，死精子凝集等情况能造成死活精子分布不均匀，严重影响结果的可靠程度。有条件的实验室使用流式细胞仪可以较为可靠地进行检测，但是流式细胞仪价格昂贵难以普及，仅限于少数实验室使用，无法成为医院里的常规检查项目；且操作复杂技术要求较高，实际应用的效率较低。

因此本领域迫切需要提供一种简便、价廉、而有效的体外检测精子存活量，即评价精子质膜完整性的方法。

发明内容

本发明旨在提供一种体外检测精子存活量的方法。

在本发明中，提供了一种体外检测精子存活率的方法，所述的方法包括步骤：

(a)将精子悬浮液和膜通透性的核染料混合得到待测样品1；所述的膜通透性的核染料选自Transgreen、SYTO或SYBR；

(b)用荧光酶标仪检测待测样品1，得到第1次样品检测荧光强度；

(c)将待测样品1和碘化丙啶(propidium iodide，PI)混合得到待测样品2；

(d)用荧光酶标仪检测待测样品2，得到第2次样品检测荧光强度；和存活系数越大，精子存活量越大。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：

(a)将精子悬浮液和精子培养液分别同膜通透性的核染料混合得到待测样品1和对照样品1；所述的膜通透性的核染料选自Transgreen、SYTO或SYBR；所述的精子培养液选自：HTF(Human Tubal Fluid人输卵管液)、BWW培养液、或M16培养液；

(b)用荧光酶标仪分别检测待测样品1和对照样品1，得到第1次样品检测荧光强度和第1次对照检测荧光强度；

(c)将待测样品1和对照样品1分别同碘化丙啶(propidium iodide，PI)混合得到待测样品2和对照样品2；

(d)用荧光酶标仪分别检测待测样品2和对照样品2，得到第2次样品检测荧光强度和第2次对照检测荧光强度；和存活系数越大，精子存活量越大。

在另一优选例中，精子悬浮液和所述的膜通透性的核染料的混合大于等于20分钟后用荧光酶标仪检测待测样品1，得到第1次样品检测荧光强度。

在另一优选例中，所述的精子悬浮液是将精液和精子培养液混合。

在另一优选例中，所述的待测样品1、对照样品1、待测样品2、和对照样品2都在酶标板上。

在另一优选例中，所述的荧光酶标仪检测波长为470nm或516nm。

在另一优选例中，所述的荧光酶标仪检测时，激发光波长为485nm，吸收波长为515nm。