[发明专利]一种检测去甲睾酮(诺龙)的直接竞争酶联免疫测定试剂盒

说明书

技术领域 本发明属生物医药技术领域，药物检测，食品安全检测试剂。具体而言，本发明利用免疫反应的高灵敏性和特异性，以及酶促反应的放大效应和易检测性，建立起来的一种检测去甲睾酮(诺龙)的直接竞争酶联免疫测定试剂盒

背景技术 “19-去甲睾酮”，又称诺龙(19-Nortestosterone)是雄性激素睾酮的衍生物，为一种蛋白质同化类激素.此类激素及其类似物曾经是应用最为广泛、效果最显著的一类生长促进剂。这类激素，主要是通过调节机体代谢，影响蛋白质和脂肪代谢，而起到促进生长，增加胴体蛋白质含量，降低脂肪含量，刺激骨髓造血，加速骨生长，降低饲料消耗等作用，是养殖业中最常用的动物生长促进剂。在竞技运动中，为提高运动成绩.增强骨骼和肌肉.也有运动员非法使用。诺龙在动物体内残留，若长期摄入有这类化合物残留的食品，有引起性功能紊乱，肝肾功能损害，甚至于诱发肿瘤等潜在性危害。故欧盟各国和我国已明文禁止在饲料中添加该类物质，(作为A类残留监测药物)。体育运动竞赛时的兴奋剂监测中，这类激素占同化类激素阳性样品的60％以上.也是必检项目。

由于要求去甲睾酮在食品中不得检出。检测限在0.5ng/g(ml)或者更低，故要求高灵敏度的检测方法和手段，这对分析检测是一个挑战。现今有关去甲睾酮的检测方法，多采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)，液相色谱-质谱联用(LC-MS)或多级联用技术如LC-MS-MS，其设备要求高，技术难度大，对技术人员要求也高。本发明试剂盒利用酶联免疫测定原理，定量检测动物组织，粪便，胆汁.尿液中的去甲睾酮残留，是一种不需要昂贵的仪器投入，一般中等文化水平的人员，经过短期培训，就可掌握的检测方法。该试剂盒检测多种样品中的去甲睾酮，其线性范围为0.05ng/ml～4ng/ml，IC₅₀为0.7ng/ml左右，灵敏度为0.05ng/ml。为食品中去甲睾酮残留和体育运动中兴奋剂监测，提供了一种高效，快速，特异的检测方法。

发明内容 本发明提供一种快速检测去甲睾酮的酶联免疫试剂盒。其制备的去甲睾酮试剂盒，线性范围为0.05ng/ml～4ng/ml，IC₅₀为0.7ng/ml左右，灵敏度为0.05ng/ml。稳定期在6个月以上(4℃冰箱保存)。

本发明公开免疫原的合成，动物的免疫，特异性抗体的制备，试剂盒的调试和装配，试剂盒各种参数的确定及样品的前处理和测定方法。

去甲睾酮，化学名：17β-羟-19-去甲基-雄甾-4-烯-3-酮。缩写为19-NT，分子量274.4，为小分子物质，不具有免疫原性而仅具有免疫反应性，生产去甲睾酮的酶联免疫测定试剂盒，必须要制备对去甲睾酮有高度特异性的抗体。要获得对去甲睾酮有高度特异性的抗体，首要条件是要有一个能激发动物产生抗体的抗原。因此，免疫原的制备最为重要。其解决的方案是去甲睾酮共价连接上一个大分子物质，通常是与一种蛋白质交联。常用的有牛血清白蛋白，卵清蛋白，甲状腺球蛋白，大钥匙孔状槭血蓝蛋白等，本发明公开一种制备去甲睾酮免疫原的方法。首先用一羟胺化合物，羧甲基羟胺，修饰19-NT，生成去甲睾酮-3-羧甲基肟(19-NT-3-CMO)，后者与N-羟基丁二酰亚胺反应，用二环己碳二亚胺(DCC)或水溶性碳二亚胺{1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺，N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDAC；1-环己-3-(2-玛啉-4-乙基)碳二亚胺对甲基苯亚磺酸盐N-Cyclohexyl-N’-(2-morpholinoethyl)carbodiimidemetho-p-toluenesulfonate，，CMEC}催化，使之活化，然后与载体蛋白分子中游离胺基相连，生成去甲睾酮免疫原。

有了免疫原，第二步就是用免疫原免疫动物，本发明是免疫1.5～2kg大小的新西兰雌性家兔，获得对去甲睾酮有特异性反应的多克隆抗体。本发明提供一种能产生高滴度抗体的免疫方案。

为了检测特异性抗体，建立直接竞争酶联免疫测定，必须合成去甲睾酮与一种酶交联的抗原-酶交联物(酶标抗原)，交联的酶包括：辣-根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶等。本发明公开一种合成去甲睾酮与酶交联的方法，以制备酶标抗原，这是建立直接竞争酶联免疫测定方法的关键技术。

在以上基础上，组装检测试剂盒。用聚苯乙烯96孔或48孔酶标板，包被二抗。(选用羊抗兔抗体，有商品供给。一般选用效价高，效价在1∶1000～2000、稳定性好的二抗。)。

优化包被浓度，抗体浓度，酶标抗原浓度，使之达到检测要求。