[发明专利]一种检测去甲睾酮(诺龙)的直接竞争酶联免疫测定试剂盒

权利要求书

1.本发明公开一种测定去甲睾酮(诺龙)的直接竞争酶联免疫试剂盒。

其特征包括：免疫原的制备，酶标抗原的制备，抗体制备和试剂盒各组份的配制及酶标板的包被。

2.根据权利1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，合成去甲睾酮免疫原的方法。用去甲睾酮溶于无水吡啶，搅拌下，加入羧甲基羟胺，去甲睾酮与羧甲基羟胺的摩尔比为1∶1.5左右，室温搅拌24小时后，减压抽干吡啶，得黄色油状物。加乙酸乙酯溶解，用蒸馏水洗三次，分离出有机相。加热减压去乙酸乙酯近干，加3ml乙醚，置冰箱，得白色沉淀。为去甲睾酮-3-羧甲基肟，再与N-羟基丁二酰亚胺反应，用二环己碳二亚胺(DCC)或水溶性碳二亚胺{1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺；1-环己-3-(2-玛啉-4-乙基)碳二亚胺-对甲基苯亚磺酸盐}催化，得去甲睾酮-3-羧甲基肟活化物，该活化物与载体蛋白在碱性条件下，与载体蛋白上氨基相联，为去甲睾酮的免疫原。载体蛋白如：牛血清白蛋白，卵清蛋白，甲状腺球蛋白，大钥匙孔状槭血蓝蛋白。

3.根据权利1-2所述，其特在于，合成一种酶标抗原的方法：用去甲睾酮-3-羧甲基肟活化物，在碱性条件下与酶相联，其酶可为：辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶。

4.根据权利1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，试剂盒溶液的优化配制。：标准溶液和样品的配制，是用含0.1％～0.5％水杨酸钠和0.05％～0.1％吐温-20的0.1～0.01M的磷酸盐缓冲溶液。

抗体稀释液用含0.1～0.5％明胶的0.1～0.01M磷酸盐缓冲溶液。

显色液为二组份，其中，一组份为显色缓冲液，由磷酸氢二钠和柠檬酸组成，每毫升含0.2～0.5μl 30％H₂O₂；另一组份为四甲基联苯胺(TMB)液。TMB液用95％乙醇或二甲亚砜配制成1mg/ml浓度。

5.根据权利1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，用采用羊抗兔抗体(二抗)包被96或48孔酶标板。用2％卵清蛋白液封闭孔中未吸附二抗的部位。

6.一种用直接竞争酶联免疫测定方法，测定各种样品中去甲睾酮(诺龙)的方法。其特征在于：

(1)样品的前处理方法。用溶剂抽提方法，大大简化了测定过程。

(2)用权利1-5所述工艺组装的试剂盒测定，检测过程为：

用包被有羊抗兔抗体的酶标板，加入去甲睾酮抗体，孵育后洗涤甩干，加入标准或样品溶液和酶标抗原(去甲睾酮-辣根过氧化物酶)，孵育后洗涤甩干，加显色剂显色，终止，测定。标准或样品去甲睾酮浓度的对数值与OD₄₅₀值呈反比。以此达到定量测定去甲睾酮的目的。此直接竞争酶联免疫测定试剂盒，检测范围为0.05～4ng/ml，灵敏度可达0.05ng/ml。