[发明专利]一种用于检测I型副流感病毒的靶序列及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，特别是涉及一种利用聚合酶链式反应扩增I型副流感病毒HN基因，从而高灵度地特异检测临床样品中I型副流感病毒的方法及利用该方法获得的实时荧光RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

副流感病毒(parainfluenza virus，PIV)，与流感病毒同属粘病毒。1992年第四次国际病毒命名委员会将其划归副粘病毒科(paramyxiviridae)，副粘病毒亚科(paranyxivirinae)。其成员多数是引起人畜共患病的重要病原体。近年来又发现一些新现病毒如megamyxoviruses(Hendra and Nipah viruses)以及metapneumovirus。

副流感病毒是幼儿、儿童和成人的显着上呼吸道感染最常见的病原体，据统计，大约30％～40％的婴幼儿急性呼吸道感染都是由人副流感病毒(human parainfluenzavirus，HPIV)引起的。和呼吸道合孢病毒一样，副流感病毒可以重复感染。副流感病毒分为一至四型，每种亚型都有不同的临床和流行病学特点。一型和二型副流感病毒是儿童哮吼症的主要原因，在2-4岁儿童中症状最严重。一型和二型副流感病毒也可导致其他上/下呼吸道病症。二型副流感病毒较少发现。三型副流感病毒虽然也导致哮吼症，但是它作为仅次于呼吸道合孢病毒的幼儿支气管炎、肺炎的病原体更为人熟知。三型副流感病毒在1岁以下儿童中症状最严重。四型副流感病毒一般引起轻微上呼吸道疾病。

要消灭I型副流感病毒需要多方努力，如发展快速诊断方法、研制新药、进行分子机制研究和疫苗研究等，其中发展快速诊断方法最为紧迫。目前I型副流感病毒常用直接或间接免疫荧光技术检测病毒抗原方法进行诊断，达不到早期诊断的目的。为了更快地检查出标本中的I型副流感病毒，需要开发利用聚合酶链式反应(PCR)对I型副流感病毒的核酸进行扩增检测。

近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高，特异性好，速度快等优点在基因表达水平分析、病原体的定性检测和定量检测等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量的主要方法。国内目前也已有关于乙肝、艾滋病、结核定量检测的试剂盒上市。

对于聚合酶链式反应(PCR)来说，选择待扩增的靶DNA的碱基序列最为重要。针对I型副流感病毒，这个碱基序列必须为I型副流感病毒特异拥有并且不能存在于为人类或其它生物DNA基因组及可能发生合并感染的其它物种中。

副流感病毒根据遗传性与抗原性，HPIV可分为4种血清型：HPIV1～4。其中HPIV4又可分为A，B两个亚型。病毒有包膜，包膜上有两种刺突，一种是HN蛋白，具有HA和NA的作用；另一种是F蛋白，具有使细胞融合及溶解红细胞的作用，它由F1和F2亚基通过2个二硫键连接而成。病毒包膜内为核衣壳，也称RNP核心，由病毒RNA(vRNA)，N蛋白，P蛋白和L蛋白组成。副流感病毒基因组由不分节段的ssRNA组成，包括约15，500个核苷酸，编码至少6种常见的结构蛋白(3’-N-P-C-M-F-HN-L-5’)。研究发现，HN糖蛋白很可能以四聚体形式存在于HPIV包膜和被感染细胞的胞膜上，通过唾液酸受体使病毒吸附于宿主细胞表面，发挥神经氨酸酶活性。Moscona和Paluso的实验表明，HN与细胞受体的相互作用是特异而复杂的，它涉及HN和F这两种表面糖蛋白，且因HPIV型别的不同而多有变化，因此，人副流感病毒血清型可根据HN基因进行分型。基于此，本领域迫切需要开发新高特异性地检测I型副流感病毒的方法和试剂盒，以便能够有效检测I型副流感病毒。

发明内容

所要解决的技术问题

本发明的目的就是提供一种有效检测I型副流感病毒的方法和试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种检测I型副流感病毒的遗传标记物，它具有SEQ IDNO：1中连续的75～1894个核苷酸。

在另一优选例中，所述的遗传标记物具有SEQ ID NO：2中第1～162个核苷酸。

在本发明的第二方面，提供一种检测I型副流感病毒的试剂盒，它含有特异性扩增I型副流感病毒遗传标记物的引物对，所述的引物长度为15～30个核苷酸，且一个引物的序列与SEQ ID NO：1所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ ID NO：1所示的序列互补，且扩增产物长度为75～1894个核苷酸。