[发明专利]人类原癌基因KRAS的检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域临床分子诊断技术，尤其涉及一种人类原癌基因KRAS的检测方法及试剂盒。

背景技术

现有检测人类原癌基因KRAS的技术分为2类，一类是采用酶联免疫的方法检测kras基因的表达水平，而非基因突变水平，表达水平仅能提供mRNA水平的参考数据，而并非DNA水平，并且表达水平仅和肿瘤发生相关，和化疗药物疗效无关。

第二类也是采用检测DNA水平的基因突变，但是采用芯片杂交技术(寡核苷酸杂交检测技术，即利用相关突变的寡核苷酸与受检对象DNA进行杂交来确定突变类型)。该专利号为200480043145(韩国专利)，对实验条件要求高，结果不稳定，准确度不够高，因此不利于临床标准化应用。而且芯片杂交的方法只能检测已知的突变，不能够对未知突变进行筛查。

因此本领域迫切需要开发一种准确度高，结果稳定，可以同时筛查kras基因突变，且便于临床操作和标准化应用的KRAS基因突变的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确度高，结果稳定，便于临床操作和标准化应用的KRAS基因突变的检测方法。

本发明的另一目的是提供一种检测KRAS基因突变的试剂盒。

本发明采用标准化的操作流程和方法将测序应用于人类KRAS基因突变的检测，创新性的一次性进行2-4个外显子的扩增反应。发明人扩增并测序的外显子是2，3，4，5外显子，其中KRAS第一外显子由于不编码蛋白质的氨基酸，因此一般的研究或检测均不包含，无检测意义。我们采用标准化的数据分析方法，使得该应用能够实现于临床，为临床遗传分子诊断和临床消化道化疗药物使用指导提供解决方案。

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种KRAS基因突变的检测方法，包括步骤：

(a)抽提样品中的DNA，用特异性引物在特定的扩增条件下进行PCR扩增；

(b)对扩增产物进行测序，与正常KRAS基因比较，是否存在基因突变。

上述样品选自血液、组织或其他体液。样品可以是制作好的石蜡标本或病理切片或细胞。

上述KRAS基因突变的检测方法，所述步骤(a)中同时用2对以上针对KRAS基因不同外显子的特异性引物进行PCR扩增。所述特异性引物含有15-30个核苷酸，优选20-27个核苷酸。

上述特异性引物选自下组中的2对以上(包括2对)：

(a)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；

(b)SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；

(c)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；

(d)SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。

上述步骤(a)中同时用3对或4对针对KRAS基因不同外显子的特异性引物进行PCR扩增。

较佳的，上述特异性引物为以下4对：

(a)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；

(b)SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；

(c)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；

(d)SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。

上述检测方法，在步骤(b)之前还包括一步骤，将步骤(a)中的扩增产物进行纯化。在进行纯化时优选使用碱性磷酸酶(SAP)和Exo I酶。

本发明提供了一种检测KRAS基因突变的试剂盒，其特征在于，它含有2对以上针对KRAS基因不同外显子的特异性引物。优选的，所述试剂盒包括3对或4对针对KRAS基因不同外显子的特异性引物。

上述特异性引物选自下组中的2对以上(包括2对)：

(a)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；

(b)SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；

(c)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；

(d)SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。

较佳的，上述特异性引物为以下4对：

(a)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；

(b)SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；

(c)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；

(d)SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。

上述试剂盒还含有PCR扩增试剂。所述PCR扩增试剂包括Taq DNA酶、4种dNTP(脱氧核苷三磷酸)和MgCl₂。