[发明专利]人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液质联用定量检测法

说明书

技术领域

本发明涉及医药检测技术领域，具体涉及一种人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的 定量检测方法。

背景技术

三聚氰胺(Melamine，2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪)，是一种三嗪类含氮杂 环有机化合物，分子式C₃N₃(NH₂)₃，分子量126.12。结构式为：

三聚氰胺遇强酸或强碱水溶液水解，胺基逐步被羟基取代，先生成三聚氰酸 二酰胺，进一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸：

由于蛋白质主要由氨基酸组成，其含氮量一般不超过30％，而三聚氰胺的分 子式(C₃N₆H₆)含氮量为66.7％。现阶段通用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”， 是通过测出含氮量来估算蛋白质含量，因此，不法分子在食品中添加三聚氰胺使 得食品的蛋白质测试含量上升。1978年Newton和Utley发现三聚氰胺具有这种 作用，近期曝光的三鹿婴幼儿奶粉中含有大量三聚氰胺也是基于同样的缘由。

毒性学研究表明三聚氰胺在体内的毒性非常微弱，大鼠口服的LD₅₀(半数致 死量)为3161mg/kg。1994年国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国 际化学品安全手册》第三卷和国际化学品安全卡片指出：长期或反复大量摄入三 聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。动物实验表明三聚氰胺在尿内 形成草酸钙结晶，与泌尿系统结石有明显的关联性，并可引起肾功能衰竭，导致 动物死；近期在我国所发生婴儿死亡事件也支持这种观点。

据报道，三聚氰胺在不同物种中代谢存在差异。其在猪体内的其半衰期大约 为4.04±0.37h，是老鼠体内(2.71h)的1.5倍，其原因为老鼠的肾脏清除率 是猪的5倍。三聚氰胺在体内的清除机制并不明确，但是根据其作为极性小分子 的理化性质，以及猪体内的清除率(27ml/min)和肾小球滤过率(31-42ml/min)， 可以认为主要经肾脏清除。雄性Fischer大鼠的毒代研究表明，24h 90％的口服 剂量在尿中清除，28小时已经超过99％，肾脏和膀胱中三聚氰胺的量高于其他组 织。体内清除速度如此之快，说明三聚氰胺可能很少在体内聚集。动物实验研究 表明，在猪体内三聚氰胺的表观分部容积为0.61(±0.04)L/kg，接近体液的总 量，故推测三聚氰胺在猪体内主要分布于细胞外液，大部分器官组织中并不存在。 现有的文献资料表明，三聚氰胺在不同的哺乳动物中的代谢特征有较大的差异； 有关三聚氰胺在人体的代谢情况尚未见报道。

目前常见的三聚氰胺检测方法有高效液相色谱法(HPLC法)、反相HPLC法、 液相色谱串联质谱法、气相色谱质谱联用法、升华法、离子交换色谱-紫外检测 法。样品来源主要为动物食品、饲料、乳制品。样品处理方法多需固相萃取、过 滤、衍生化处理等步骤，测定方法中均未见同位素内标的使用。

2008年9月媒体报道三鹿婴幼儿奶粉中检测出三聚氰胺，并导致食用该奶 粉的婴幼儿发生肾结石的重大食品安全事件，引起了全社会的关注。建立可靠灵 敏的人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)定量检测方 法，以便能及时了解人体内三聚氰胺的残留情况、临床跟踪观察并采取有效的诊 疗措施等，均具有十分重大的临床意义。

有关三聚氰胺和三聚氰酸在人尿中的检测方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是：提供一种操作简便、专一灵敏的临床人尿中三聚氰胺和 三聚氰酸定量检测方法，以满足临床的需求。

本发明公开的定量检测的方法包括：采用同位素稀释技术，在尿样的预处 理时分别加入含13C3；15N3-三聚氰胺或氘代三聚氰胺和13C3；15N3-三聚氰酸的 内标溶液；液-液萃取法分别提取尿中三聚氰胺和三聚氰酸；建立LC-MS/MS方法 分别定量检测人尿中三聚氰胺和三聚氰酸浓度，液相色谱以苯基、氟苯基、硅胶 等填料柱为固定相，甲醇、乙腈、水、甲酸溶液或混合液为流动相，色谱分离进 行等度洗脱或梯度洗脱，质谱检测采用电喷雾电离源(ESI)检测人尿中三聚氰 胺和三聚氰酸含量。三聚氰胺和三聚氰酸的最低定量限可达10ng/ml。

本发明方法包括以下步骤：

1、样品预处理