[发明专利]一种定型内胚层细胞的制备和分离方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种定型内胚层细胞 (Definitive Endoderm，DE)的制备和分离方法。

背景技术

源于胚泡期内细胞团的胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ES)具有多全 能性，在合适的培养条件下，可以使其维持近似均一且理论上无限的自我更新 能力；而在特定的诱导条件下，它们能够向几乎所有体细胞分化。胚胎干细胞 为现代生命科学和药物科学研究提供了良好条件，是研究哺乳动物早期胚胎发 育的理想模型，也在基于细胞的生物治疗(Cell-Based Therapy)和药物筛选、毒 理测试等研究中起到重要作用。

近年来，对胚胎干细胞自我更新及哺乳动物胚胎发育的分子机制的进一步 了解使得干细胞向体细胞定向分化已成为干细胞生物学研究的热点，也在再生 医学领域越发受到重视。之前的研究工作表明，小鼠ES细胞向包括神经元、 心肌细胞、肝脏细胞、内分泌胰腺细胞等在内的体细胞的定向分化已取得了一 定进展；人类胚胎干细胞向神经元、激素分泌胰腺细胞分化已取得一定进步， 但关于人类胚胎干细胞向肝脏细胞的分化研究少有报道。

中国肝脏疾病的发病率高，影响面广，对国人健康和社会经济的影响巨大。 特别是乙肝病毒等嗜肝性病毒感染在临床上可以引起肝炎、肝硬化和肝癌的发 生，而目前又缺乏真正有效的治疗方法。所以，发展全新的肝脏疾病的治疗方 法不仅具有重要的医学意义，而且更加具有特殊的社会影响和潜在的经济效 益。特别令人鼓舞的是，在体外实验中已有可能使胚胎干细胞和来源于肝组织 的肝干细胞分化为肝前体细胞、成熟的肝细胞及胆管细胞，并在活体动物的移 植实验中也观察到外源的干细胞对损伤肝脏的再殖(Repopulate)，使损伤肝脏在 结构上和功能上得到有效的恢复。这些进展的取得，充分显示了利用干细胞对 人类肝脏疾病进行临床治疗的可能性。

小鼠和人ES细胞体外分化的研究表明，ES细胞的肝向分化能在一定程度 模拟在体发育过程，使得体外分化具有较好的理论依据。因此，对哺乳动物肝 脏发育的分子机制的了解，有助于指导胚胎干细胞肝向分化。然而，哺乳动物 肝脏发育是一个在时间和空间上受到精确调控的生物学事件，这就决定了肝向 分化的复杂性。干细胞肝向分化尚有许多问题待于解决，如诱导效率低、重复 性差、细胞成分混杂(各个胚层基因表达具有相似性，难于区分特定的细胞群)、 分化细胞的真实性等。因此，探索高效可重复的胚胎干细胞肝向诱导的方法势 在必行。胚胎干细胞肝向分化的第一步是获得高比例且较纯的内胚层细胞。综 合本技术领域以往的研究，胚胎干细胞向定型内胚层分化有三个技术问题还需 要解决：

首先需要解决的问题是如何提高诱导效率。研究已经发现，通过单层培养 诱导(Monolayer culture)，Activin A(激动素)能够模拟Tgf-b信号通路的作用， 促进ES细胞分化成Gsc+中内胚层(Mesoendoderm)，进而分化成内胚层样细 胞；而通过形成拟胚体(Embryonic Body，EB)，Activin A也能促使ES细胞 分化成Brachury+原条样细胞，进一步形成内胚层细胞；同时Activin A的诱导 作用也在人胚胎干细胞向内胚层分化中被证明。然而，尽管如此，这些诱导方 法的效率都不高，低于50％。

其次需要解决的问题是如何区分定型内胚层和内脏内胚层(Vecial endoderm，VE)。在哺乳动物发育过程中，VE来自原始内胚层(Primitive endoderm，PE)，不参与器官发育，但VE和DE共同表达很多相同的基因，而 且VE很容易被诱导出来，之前的诱导方法因无法较好地区分VE和DE，得到 的往往是一个混合的细胞群。

再次需要解决的问题是如何将DE从分化的细胞群中挑选出来。利用荧光 激活的细胞分选技术(Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS)，只要选定合 适的表面抗原，就可以将特定细胞群标记并分离。现在所知的DE特异表达的 表面抗原还很少，因此有必要选定能够正确区分胚内和胚外细胞，以及中胚层 (Mesoderm)和定型内胚层的表面标记。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定型内胚层细胞(DE)的制备和分离方法。

本发明的另一目的在于提供一种用于促进定型内胚层细胞向分化的分化 培养基。

本发明的另一目的在于提供一种可用于分选内胚层细胞的表面标记。