[发明专利]一种定型内胚层细胞的制备和分离方法

权利要求书

1.一种制备含定型内胚层细胞的细胞群的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)培养胚胎干细胞，形成拟胚体；和

(2)用含活化素A、Wnt信号通路激动剂和BMP4信号通路抑制剂的分化培养基处理拟胚体，诱导拟胚体分化，从而获得含有定型内胚层细胞的细胞群，所述细胞群中定型内胚层细胞占60％以上；

所述的Wnt信号通路激动剂选自：(2’Z，3’E)-6-Bromoindirubin-3′-肟或LiCl；并且，LiCl的用量是0.5-10mM或(2’Z，3’E)-6-Bromoindirubin-3′-肟的用量是0.5-5μM；

所述BMP4信号通路抑制剂是Noggin。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，Noggin的用量是100-600ng/ml。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，活化素A的用量是：20-100ng/ml培养基。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

LiCl的用量是1-8mM；或

(2’Z，3’E)-6-Bromoindirubin-3′-肟的用量是0.8-4μM。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

(3)从(2)获得的细胞群中分离出定型内胚层细胞群。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的从(2)获得的细胞群中分离出定型内胚层细胞群的方法是：

分选细胞表面Cxcr4分子阳性且c-Kit分子阳性的细胞群，所述的细胞群是定型内胚层细胞群；或

分选细胞表面Cxcr4分子阳性且CD140α分子阴性的细胞群，所述的细胞 群是定型内胚层细胞群；或

分选细胞表面Cxcr4分子阳性且EpCam分子阳性的细胞群，所述的细胞群是定型内胚层细胞群。

7.一种含定型内胚层细胞的细胞群，所述细胞群中定型内胚层细胞占60％以上，所述的细胞群采用以下方法获得：

(1)培养胚胎干细胞，形成拟胚体；和

(2)用含活化素A、Wnt信号通路激动剂和BMP4信号通路抑制剂的分化培养基处理拟胚体，诱导拟胚体分化，从而获得含有定型内胚层细胞的细胞群；

所述的Wnt信号通路激动剂选自：(2’Z，3’E)-6-Bromoindirubin-3′-肟或LiCl；并且，LiCl的用量是0.5-10mM或(2’Z，3’E)-6-Bromoindirubin-3′-肟的用量是0.5-5μM；

所述BMP4信号通路抑制剂是Noggin。

8.如权利要求7所述的细胞群，其特征在于，在步骤(2)之后，还包括：

从所述含有定型内胚层细胞的细胞群中分选细胞表面Cxcr4分子阳性且c-Kit分子阳性的细胞群，得到定型内胚层细胞群；或

从所述含有定型内胚层细胞的细胞群中分选细胞表面Cxcr4分子阳性且CD140α分子阴性的细胞群，得到定型内胚层细胞群；或

从所述含有定型内胚层细胞的细胞群中分选细胞表面Cxcr4分子阳性且EpCam分子阳性的细胞群，得到定型内胚层细胞群。

9.一种用于制备定型内胚层细胞的分化培养基，其特征在于，所述的分化培养基含有：

无血清胚胎于细胞分化培养基，以及：

20-100ng/ml活化素A；

0.5-10mM LiCl或0.5-5μM(2’Z，3’E)-6-Bromoindirubin-3′-肟；和100-600ng/ml的Noggin。

10.如权利要求9所述的分化培养基，其特征在于，所述的无血清胚胎干细胞培养基含有：70-80％体积比的IMDM；20-30％体积比的F12培养基；其中 还添加：

按照体积0.2-2％N2添加物；

按照体积0.5-2％B27添加物；

0.2-1mg/ml的BSA；

0.2-1mM的维生素C；和

0.2-0.8mM的3-巯基硫代甘油。

11.权利要求9-10任一所述的分化培养基的用途，其特征在于，用于制备含定型内胚层细胞的细胞群，所述细胞群中定型内胚层细胞占60％以上。