[发明专利]乳铁蛋白的亲和分离材料和乳铁蛋白的亲和纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物医药技术领域的纯化方法，特别是一种乳铁蛋白的亲和分离材料和乳铁蛋白的亲和的纯化方法。

背景技术

乳铁蛋白又名乳转铁蛋白，是一种分子质量为70～80kDa的糖蛋白，属于转铁蛋白家族成员，广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中(包括泪液、精液、胆汁、滑膜液等内、外分泌液和嗜中性粒细胞)。除参与铁代谢外，乳铁蛋白及其蛋白降解产物—乳铁蛋白肽还具有广泛的生物学活性，包括广谱抗菌和抗病毒活性，抑制肿瘤细胞生长，调节机体免疫反应和抗炎症，抗氧化作用，作为细胞生长因子等，被认为是一种新型抗菌、抗病毒、抗癌药物和极具潜力的食品、化妆品和饲料添加剂。美国食品药品管理局早已允许乳铁蛋白作为食品添加剂用于运动、功能性食品。

目前乳铁蛋白主要来源于哺乳动物乳汁(如牛乳，羊奶和人乳)和利用基因工程技术在真菌、植物和乳腺组织中表达乳铁蛋白产物。

经对现有技术文献的检索发现，从乳清中制备乳铁蛋白的方法主要为阳离子交换层析，如中国专利200410080264“牛初乳中乳铁蛋白的分离纯化技术”，中国专利200710102035“一种从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋白的方法”；由于单用阳离子交换色谱纯化乳铁蛋白回收率低且纯度有限，中国专利“200610040528一种从牛初乳中工业化分离纯化乳铁蛋白的方法”将膜分离技术和工业色谱技术相结合，先将乳清经分步超滤获得乳铁蛋白粗制品，再经强阳离子交换得乳铁蛋白精制品。该纯化方法步骤较多，操作复杂且成本高，使得工业化应用受限。中国专利03152940“牛初乳中乳铁蛋白的分离提纯工艺方法”利用肝素—琼脂糖亲和层析柱从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白，该法获得产品纯度高，但得率较低且生产成本较高。因此，有必要开发效率高、成本低、生产步骤更简便的乳铁蛋白分离材料和和生产工艺。

发明内容

本发明的目的在于克服乳铁蛋白生产现有纯化技术的缺点，提供一种乳铁蛋白的亲和分离材料和乳铁蛋白的亲和的纯化方法，能够快速、简便、低成本、大批量纯化乳铁蛋白。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明的纯化方法，即仿生亲和纯化技术，以专一性地识别乳铁蛋白作为基础，其步骤如下：

第一步，在基础层析介质上进行固相合成，制备仿生亲和分离材料；

合成乳铁蛋白专一的亲和分离材料，首先以带氨基的基础层析介质，或用常规化学方法对基础层析介质进行衍生化，带上氨基，与三氯三氮嗪反应活化，再与Beta-丙氨酸或1-氨基环己烷甲酸反应，合成亲和分离材料。

第二步，用制备的仿生亲和分离材料纯化乳铁蛋白。

用上述合成的亲和分离材料制备成亲和层析柱，将乳清样品流经该亲和层析柱，乳铁蛋白吸附在亲和层析柱上，未结合的其它蛋白被洗去，改变缓冲液条件将结合的乳铁蛋白洗脱下来，得到乳铁蛋白粗品。

第二步中，所述用制备的仿生亲和分离材料纯化乳铁蛋白，其中亲和介质吸附乳铁蛋白的条件为pH6.0-7.5，NaCl浓度为0.0-0.2M的缓冲液；洗脱条件为pH2.0-3.0，NaCl浓度为0-0.15M的缓冲液。

所述的仿生亲和分离材料的配体中含有三氮嗪和Beta-丙氨酸或1-氨基环己烷甲酸的结构。

所述的乳铁蛋白，其原料为牛乳、羊乳、人乳和含重组人乳铁蛋白的转基因牛乳中一种。

本发明仿生亲和分离材料结构是通过三氮嗪结构骨架作为间臂固定Beta-丙氨酸或1-氨基环己烷甲酸基团。本发明克服了乳铁蛋白生产技术中的缺点，在纯化乳铁蛋白时步骤少，生产成本低，生产效率高，利用乳铁蛋白专一的亲和分离材料，可快速、简便、低成本、大批量纯化乳铁蛋白。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实例1：

一分离材料制备

取NH₂-Sepharose(500ml)，依次用5倍体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤后，抽干转移至反应器皿中，在冰水浴中加入丙酮溶解的三氯三氮嗪(100g)，搅拌下用饱和NaHCO₃调节pH在6~7之间，反应3小时后取出，依次用3×10倍体积的水/丙酮(0:1，1:3，1:1，3:1，1:0)洗涤，得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(450ml)。