[发明专利]基于ISSR分子标记构建中国长豇豆遗传资源数据库的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物品种遗传资源数据库建立及应用，具体涉及一种基于ISSR分子标记构建中国长豇豆遗传资源数据库鉴定的方法以及数据库的应用。

背景技术

豇豆(Vigna unguiculata L.Walp.)是一种重要的豆科植物，全球种植面积超过12500万公顷，年产量超过300万吨。其中，长豇豆(V.sesquipedalis)是豇豆中经济性上最重要的一个亚种，可菜用、粒用，还可作动物饲料，因而被广泛种植于东南亚与中国。中国是长豇豆的次生起源中心，具有悠久栽培历史。中国地域辽阔、生态环境复杂，长豇豆在全国各地都有种植，因此形成了丰富的长豇豆地方品种。然而至今为止，没有人系统地对中国丰富的长豇豆品种资源从DNA分子标记的角度进行遗传关系分析，这给长豇豆品种资源鉴定、评价、保存与利用带来了相当大的困难。加之近年来长豇豆育种工作日见成效，新品种在全国各地都得到了推广而逐渐取代传统地方长豇豆品种，如果不及时对地方品种资源进行鉴定保存，这些宝贵的基因资源就会面临丢失的危险。

特异性、一致性与稳定性(DUS)是植物新品种资源必须具备的特征。长期以来，品种资源鉴定一直采用形态性状为主，生理特性为辅的方法，这些特性是授予新品种权的依据，也是开展品种鉴定、解决品种争议的基础。但是，这种经典鉴定一般只在植物完成整个生长周期，甚至于收获后才能完成；同时很多性状属于数量性状，存在连续变异、易受环境影响的特点，不利于品种资源特性的明确描述；再者，同一物种，同一类型的品种资源数目巨大，且新品种数目逐年累加，鉴定机构仅根据形态性状、生理特性，实际上无法确定待审品种是否有别于其它品种。越来越多的研究表明，DNA分子标记的应用极大的推动了这些问题的解决。国际新品种保护联盟(UPOV)将DNA标记的DUS测试列入议事日程，中国也于1997年开始实施植物新品种保护。

近年来，各种DNA分子标记被广泛应用于在豇豆属或种内种质资源亲缘关系分析，如SSR，RAPD，RFLP，AFLP、DAF、SAMPL和ISSR标记。进行属或种内的研究对于植物分类与进化具有重要意义；而进行亚种内栽培种的研究则对于种质资源的保存与有效利用，特别是对于育种工作的开展具有重要意义。然而国内外针对豇豆属中长豇豆亚种的遗传资源亲缘关系的研究还很少，且很不系统。Phansak等对全球范围内15个长豇豆品种在16个SSR标记位点上的多态性进行了分析，其中中国的长豇豆品种仅3个，由于品种数少，在全基因组范围内检测的位点数也仅有16个，因此其结果对长豇豆品种特别是中国长豇豆品种的代表性较差；陈禅友等对长豇豆品种资源做了形态学分析。目前还未见对整个中国长豇豆品种分子标记方面的报道。

各种分子标记在豇豆资源鉴定中各有其自身优势与不足。SSR标记引物序列特异，多态性高且为共显性，在资源与种子纯度鉴定等方面应用最为广泛，然而目前在整个豇豆属中有差异的有效SSR标记仅20多个，由于长豇豆亚种内品种间亲缘关系更近，因而有效SSR标记更少，还远不能满足实际应用的需要。RAPD标记检测的位点多，引物通用，但普遍认为不够稳定，而且在豇豆中RAPD标记不能反应血缘关系，被认为不适合做豇豆亲缘关系分析。AFLP与SAMPL标记的多态性很高，能够有效区分普通豇豆(V.unguiculata)不同品种，然而酶切、扩增与PAGE检测程序复杂，费用高，在基础研究中应用较多而在品种纯度或资源鉴定等应用研究中应用较少。ISSR是由Zietkiewicz等提出的用于扩增两个SSR位点间序列的一种方法。其原理是：同一ISSR引物序列同时与两个较近但方向相反的SSR重复序列互补结合而扩增这两个SSR位点间的序列。因此ISSR变异同时来源于SSR序列内与序列间的变异，具有很高的多态性，ISSR技术被认为比RFLP更便宜，比RAPD重复性更高。在豇豆中，ISSR技术被认为更适合于遗传多样性较低的栽培品种内的遗传分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于ISSR分子标记构建中国长豇豆遗传资源数据库鉴定的方法，并提出中国长豇豆遗传资源数据库鉴定的应用。

本发明的技术方案为：基于ISSR分子标记构建中国长豇豆遗传资源数据库鉴定的方法，其包括以下步骤：

(1)收集中国长豇豆品种资源，田间形态鉴定品种种内单株间的一致性与典型性，放弃分离与不典型的材料，对一致性与典型性品种的单株提取DNA；

(2)利用高多态性的3个ISSR标记鉴定初选单株间DNA水平的一致性，最终决选构建指纹图谱的品种与单株；