[发明专利]一种摇瓶培养基及提高葡萄糖氧化杆菌催化能力的方法

说明书

所属技术领域

本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种摇瓶培养基及提高葡萄糖氧化杆菌催化能力的方法。

背景技术

米格列醇(migliton)是拜耳公司在1997年度上市的新型抗糖尿病药物。它是从杆菌肉汤培养基中发现的一种新型肠道α-葡萄糖苷酶抑制剂，是1-脱氧野尻霉素的母体修饰产物，属于N-取代-1-脱氧野尻霉素类型，结构与葡萄糖相似。尽管用化学合成的方法能够制备米格列醇，但化学全合成法制备米格列醇的步骤较多，米格列醇分子中含有的四个手性中心也给化学合成带来了很大的困难。目前生产规模大多采用生物合成来制备米格列醇。米格列醇的生物合成法据文献报道大致有二条路线：一是先由野尻霉素或1-脱氧野尻霉素产生菌进行发酵，制备获得野尻霉素或1-脱氧野尻霉素，然后再经过化学合成方法获得米格列醇，这是最原始的途径；二是应用氧化葡糖酸菌转化制备米格列醇关键中间体N-取代-1-脱氧野尻霉素，其主要通过化学合成-生物转化-化学合成的方法来制备，该工艺路线图如下：

上述(I)为1-羟乙胺基-1-脱氧-D-山梨醇，(II)为呋喃型葡萄糖胺，(III)为米格列醇。

US4266025，EP0477160，USP2001/0019837公布了另外的米格列醇的生产方法，即化学合成结合生物催化的方法。但由于菌体活力不高，导致生物催化时间过长，造成生产成本高，生产周期长，给工业化生产带来很大的障碍。

由于微生物酶的高效专一性，省略了化学合成过程中为达到专一地改造某个目 的基团必须进行的加入和脱除保护基团的步骤，大大简化了制备过程，提高了反应收率。氧化葡糖酸杆菌用于转化特定底物制备1-脱氧野尻霉素及其衍生物具有很多优点：1)转化液经离心除去菌体，无需分离纯化出中间体，就可进行下一步合成。2)无需基团保护，成本大大降低，且避免因去除保护剂而造成的回收率下降。3)中间体6-(取代胺基)-6-脱氧-α-L-山梨呋喃糖具有较高的溶解度和稳定性，不易被降解。但对于转化机理的报道还没有，可以肯定的是，葡萄糖氧化杆菌中含有参与该转化反应的生物酶或酶系，葡萄糖氧化杆菌的催化能力与其含有的生物酶系的数量和活力有直接关系。

目前，米格列醇虽然已经实现工业化生产。但由于菌种活力低，使利用微生物将1-羟乙胺基-1-脱氧-D-山梨醇转化为呋喃型葡萄糖胺时转化效率低，转化时间长，劳动强度大，生产成本高。传统菌种选育主要采用诱变育种的方法，诱变的方法历史悠久，过去一直依赖诱变的方法来提高产量，目前大多数生物发酵工业生产仍然在使用这些方法。但是这种方法具有相当大的随机性，而且菌种若长期使用诱变剂处理，其生活能力会逐渐下降。

目前，还没有文献报道通过改进培养基的方式来提高葡萄糖氧化杆菌催化能力的相关报道。

发明内容

本发明另辟蹊径，通过优化发酵条件的方式，提出了一种可以增强葡萄糖氧化杆菌脱氢酶系活力的摇瓶培养基，以及一种提高葡萄糖氧化杆菌催化能力的方法。

本发明人在试验过程中意外地发现，在已有的摇瓶培养基中加入1-羟乙胺基-1-脱氧-D-山梨醇，可以提高葡萄糖氧化杆菌脱氢酶系活力，这种偶然发现是我们意想不到的。为了进一步优化培养基的成分配比，发明人经过大量试验摸索研究发现，当1-羟乙胺基-1-脱氧-D-山梨醇的浓度在0.05～0.9g/L时，底物的转化率得到了很大提高；优选地，1-羟乙胺基-1-脱氧-D-山梨醇的浓度在0.2～0.7g/L时，底物的转化率更高；进一步优选地，当1-羟乙胺基-1-脱氧-D-山梨醇的浓度为0.4g/L时，底物的转化率最高。

本发明的摇瓶培养基，其成分含有1-羟乙胺基-1-脱氧-D-山梨醇，除此之外，还可以含有以下所有成分：葡萄糖、山梨醇、酵母膏、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。 同时，发明人对上述组分的配比做了筛选，发现当上述组分的浓度为葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾3g/L时，底物转化率得到了很大的提高。

无论对本发明的摇瓶培养基做出任何改进，其PH值均控制在7.0。

另外，本发明的第二个目的是提供一种提高葡萄糖氧化杆菌催化能力的方法。为了达到这个目的，发明人对发酵工艺作了一定的优化。具体地，所述的提高葡萄糖氧化杆菌催化能力的方法，包括斜面培养、摇瓶培养及生物转化过程。