[发明专利]拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合、其表达载体及用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合及其表达载体，以及通过该拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合筛选病毒包膜蛋白的受体的方法，和筛选膜融合的促进剂或抑制剂的方法。

背景技术

膜融合是生物系统中非常普遍的现象。肌肉发生，受精作用，以及囊泡的运输过程中都涉及到膜融合。具有包膜的病毒侵染宿主细胞，同样依赖于膜融合。膜融合是由2个膜所分开的2个独立区室发生合并形成一个区室的过程。人们可以使用多种不同的技术监测这个过程。一种方法是使用一对拆分蛋白，当它们相互重新结合的时候，将会重新获得其整体蛋白的活性。

在这类方法中已经建立了很多种报告蛋白系统。像天然就具有的自我组装能力的拆分β-半乳糖苷酶(β-gal)，以及拆分GFP蛋白(spGFP)都已应用于膜融合的分析中。拆分的酶可以实现定量的监测，但是如果使用的底物不具有膜通透性则需要破坏细胞膜才能实现。spGFP可以实现连续地观察活体细胞中发生的情况，但是其定量效果不如酶。

所以在现有技术里就不存在一种技术，即可以实现定量地监测体细胞融合又可以实现连续地观察活体细胞融合的蛋白或其组合以及方法。同时也缺乏一种简便地筛选病毒包膜蛋白的受体的方法，和一种简便地筛选膜融合的促进剂或抑制剂的方法。

发明内容

(一)发明的摘要

(发明所要解决的问题)

本发明经过对大量拆分蛋白的研究和实验，发现在融合二种不同种类的拆分荧光蛋白的情况下，特别是这二种不同种类的拆分荧光蛋白中的至少一种为拆分荧光酶的情况下，就可以提供即可以实现定量地监测体细胞融合又可以实现连续地观察活体细胞融合的蛋白或其组合以及方法的技术。

本发明同时也发现了现有的荧光蛋白的新的拆分点。如果使用这个新的拆分点拆分的荧光蛋白作为拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合的一部分，可以解决现有的问题。

(二)发明的详细说明

本发明的目的是提供一种拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合，包括第一拆分荧光蛋白的融合蛋白和第二拆分荧光蛋白的融合蛋白，其中，第一拆分荧光蛋白的融合蛋白，为可自我重新结合的已被拆分的第一荧光蛋白的一部分和可自我重新结合的已被拆分的第二荧光蛋白的一部分的融合蛋白；第二拆分荧光蛋白的融合蛋白，为前述第一荧光蛋白的剩余部分和前述第二荧光蛋白的剩余部分的融合蛋白，其特征在于，前述的第一拆分荧光蛋白的融合蛋白与前述第二拆分荧光蛋白的融合蛋白结合后，前述第一荧光蛋白和前述第二荧光蛋白中的至少一个，可以自我重新结合恢复拆分前的荧光功能，从而发出荧光。

本发明的另外一个目的是提供一种病毒包膜蛋白的受体的筛选方法，该方法包括以下步骤：a)将本发明(权利要求5)所述的包膜蛋白表达载体转入第一细胞中表达，b)将本发明(权利要求5)所述的另外一个不含有包膜蛋白的基因的表达载体转入第二细胞中表达，该第二细胞同时含有该包膜蛋白所对应的受体，c)混合第一细胞和第二细胞，d)检验第一细胞和第二细胞通过病毒包膜蛋白与受体结合的方式融合后的荧光，该萤光为前述第一荧光蛋白和前述第二荧光蛋白中的至少一个自我重新结合后恢复的拆分前的萤光。

本发明的另外一个目的是提供一种膜融合的促进剂或抑制剂的筛选方法，该方法包括以下步骤：a)将本发明(权利要求5)所述的包膜蛋白表达载体转入第一细胞中表达，b)将本发明(权利要求5)所述的另外一个不含有包膜蛋白的基因的表达载体转入第二细胞中表达，该第二细胞同时含有该包膜蛋白所对应的受体，c)加入促进或抑制病毒包膜蛋白与受体结合的促进剂或抑制剂，d)混合第一细胞和第二细胞，e).检验第一细胞和第二细胞通过病毒包膜蛋白与受体结合的方式而融合后的荧光，该萤光为前述第一荧光蛋白和前述第二荧光蛋白中的至少一个自我重新结合后恢复的拆分前的萤光。

(具体实施形态)

以下通过提供本发明的具体实施形态来说明本发明，但是这里说明的具体实施形态只是本发明的一个实施例而已，不是用来限定本发明的范围以及其等同范围的。属于本技术领域的技术者可以容易地理解本说明书所记述的发明范围以及本发明的等同范围。

(第一实施形态)