[发明专利]从食品样品中简易提取细菌DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细菌基因组DNA的提取方法，尤其涉及从食品样品中简易提取适用于致病菌检测的DNA的方法。

背景技术

自2004年4月安徽阜阳发生“劣质奶粉”事件以来，奶粉安全问题成为社会各界广泛关注的焦点。奶粉的主要消费群体是婴幼儿、儿童、老人或病人等免疫力较低的人群，尤其婴幼儿是奶粉的重要消费群体，因此，奶粉的安全性尤为重要，一直受到国务院、职能部门和各级政府的高度重视。2002年科技部下达了“十五”国家重大科技奶业专项，对乳制品中几种常见致病菌进行了快速检测方法的研究。由此可见，研究并建立快速准确检测奶粉中的致病菌的方法以保障奶制品的安全非常必要。

国标中检测食品中致病菌的方法多是采用传统的分离培养和生化鉴定的方法，报告检验结果大致需5～7天，加之检验方法繁琐、费时费力，不仅成为检验部门的一项沉重负担，而且越来越不能满足食品安全和日益发展的国际贸易的需要。另外，在检验环境中，也很容易造成环境和/或标本的污染。再者，传统方法还存在培养条件苛刻或某些致病菌难以培养的问题。

以PCR为基础的现代分子生物学技术为病原微生物的检测开辟了一条快速灵敏的途径。分子生物学技术应用于微生物检测首先需要用PCR方法扩增临床样品中病原体的靶核酸序列，然后用其它多种分子生物学手段对扩增产物进行分析，从而鉴定病原体的有无和种类。对扩增产物进行分析的常用方法包括电泳、杂交等。以DNA杂交为基础的基因芯片技术，更具有敏感性高、特异性强、可实现大规模集成化等优点。

分子生物学技术应用于食品致病微生物检测的核心之一是样品中病原体DNA的有效提取。食品中可能的致病菌既有G⁺菌，也有G^-菌，且食品种类复杂，成分多样，含有丰富的蛋白、脂肪、维生素、微量元素等，某些成分有强烈抑制PCR反应的作用，如果在细菌DNA提取过程中不能有效去除这些抑制成分，将会对以后的PCR反应造成很大问题。

为了克服上述缺陷，目前人们已采取了多种方法，例如对标本进行预处理并使用柱层析方法分离DNA，以及P.Cremonesi等人的方法(J.DairySci，89(2006)：163-169)。但这些方法皆因成本较高或试剂有毒且易于造成DNA的损伤等问题，而难以在基层医疗单位的实验室广泛使用。

因此，本领域有必要提供一种新的食品样品中细菌的基因组DNA的方法，以便能够以较低的成本，简单、快速地从食品样品中提取高质量的总DNA，使其适应检验检疫领域检测食品中致病菌的需要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种操作简便、易行的从食品样品中提取高质量细菌基因组DNA的方法，以适应检验检疫领域快速检测食品中致病菌的需要。

本发明提供的从食品样品中提取细菌基因组DNA的方法，主要包含步骤：

1)以含有细菌的食品为样品，过夜培养，离心富集菌体，然后用无菌水充分洗涤，得沉淀物；

2)使用含KCl，Tris-HCl，MgCl₂和蛋白酶K的裂解液重悬步骤1)所得的沉淀物，得重悬液；

3)将步骤2)所得的重悬液进行第一次水浴，裂解细菌细胞，然后再经第二次水浴；

4)将步骤3)的所得物进行离心，获得含所述细菌基因组DNA的中层上清；

5)收集步骤4)的含所述细菌基因组DNA的中层上清，烘干，即制得所述细菌基因组DNA。

本发明的较佳实施例中，步骤1)中样品可以为婴儿配方奶粉，该婴儿配方奶粉中含有沙门氏菌、志贺氏菌、化脓性链球菌、蜡样芽孢杆菌、产酸克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷氏菌、单增李斯特氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、副溶血弧菌中的至少一种致病菌。

本发明的较佳实施例中，步骤2)所述的裂解液还可以包含TritonX-100，NP40或Tween 20中的至少一种。优选地，步骤2)所述的裂解液包含KCl，Tris-HCl，MgCl₂，Triton X-100，NP40，Tween 20和蛋白酶K；具体地可以为：裂解液包含50mM KCl，10mM Tris-HCl，2.5mM MgCl₂，0.1％的Triton X-100，0.5％NP40，0.5％Tween 20和0.1mg/ml的蛋白酶K；其中Tris-HCl的pH值优选为9.0。