[发明专利]一种双链聚乙二醇－胰岛素复合物及其制备方法

权利要求书

1.双链聚乙二醇-胰岛素复合物，其特征是：其化学结构通式为D-X-R2，式中R为CH₃O-(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂NH，n＝50-250；X为L-谷氨酸残基或者L-天冬氨酸残基；D为天然猪胰岛素脱去B30位的丙氨酸残基或人胰岛素脱去B30苏氨酸残基得到的产物。

2.根据权利要求1所述的一种双链聚乙二醇-胰岛素复合物，其特征是：X为L-谷氨酸残基。

3.根据权利要求1所述的一种双链聚乙二醇-胰岛素复合物，其特征是：X为L-天冬氨酸残基。

4.根据权利要求1所述的一种双链聚乙二醇-胰岛素复合物，其特征是：R的前体是氨基聚乙二醇CH₃O-(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂NH₂，其分子量范围是2KD-10KD。

5.根据权利要求1所述的一种双链聚乙二醇-胰岛素复合物，其特征是：R与X的羧基之间为酰胺键连接；X的氨基与D的C末端B29赖氨酸的羧基之间是酰胺键连接。

6.一种双链聚乙二醇-胰岛素复合物的制备方法，其具体合成步骤如下：

第一步氨基聚乙二醇的制备：

将一定量的通式为CH₃O-(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂OH的单甲氧基聚乙二醇(n＝50-250)加入到甲苯中，加热共沸除去水分，余下的溶液加入与单甲氧基聚乙二醇等摩尔量的吡啶，回流反应并滴加2倍聚乙二醇摩尔量的氯化亚砜(SOCl₂)，滴加完毕后再于80℃-100℃反应2-6小时，冷却过滤除去结晶物，然后减压蒸馏除去甲苯，得到的产物为CH₃O-(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂Cl，将该物质放入反应釜中，以少量无水甲醇溶解，然后加入液态氨，密闭下60℃反应12-24小时开釜后减压除去过量的氨和甲醇，得到通式为CH₃O-(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂NH₂的氨基聚乙二醇，备用。

第二步X-R2的制备：

取一定量的氨基用Boc保护了的氨基酸衍生物，其化学通式为Boc-X-(COOH)₂，溶于二氯甲烷CH₂Cl₂与二甲基甲酰胺(DMF)的1∶1-1∶6体积比混合溶液中，加入2倍于氨基用Fmoc保护了的氨基酸衍生物摩尔量的R-NH₂，再加入4倍氨基用Fmoc保护了的氨基酸衍生物摩尔量的碳二亚胺(DCC)，0-10℃搅拌反应12-24小时，然后过滤除去副产物DCU，得到的溶液中加入过量的三氟乙酸，搅拌反应脱掉Boc保护基，得到X-R2，备用。此时X的两个羧基与两条氨基聚乙二醇形成酰胺连接，形成双链的聚乙二醇氨基酸衍生物，其氨基为游离状态；第三步去掉B30氨基酸残基的胰岛素中间体的制备在pH8.3的碳酸氢铵溶液中加入天然的猪胰岛素或人胰岛素，使之溶解，然后加入催化量的羧肽酶A，在37℃水浴中作用2小时，然后加酸终止反应，反应液用SephadexG50分离，冻干，得到脱掉B30氨基酸的胰岛素中间体，其B链N末端为B29-Lys，备用；

第四步双链聚乙二醇-胰岛素复合物的制备：

首先将一定量的备用的脱掉B30氨基酸残基的胰岛素中间体D用0.5-2N的醋酸溶液溶解，得溶液1；然后将备用的X-R2溶于1∶1-1∶6体积比的DMF/EtOH混合溶液中，原料胰岛素中间体与X-R2的摩尔比为1∶10-1∶60，得溶液2；最后将溶液1和2合并并调节pH至6-7，加入催化量的胰蛋白酶，在20-35℃的水浴中反应12-24小时，即可得到本发明的终产物双链聚乙二醇-胰岛素复合物。