[发明专利]从植物源食用油中提取用于转基因成分检测的DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于核酸提取领域的技术，尤其涉及植物源食用油转基因成分检测用的核酸提取方法。

背景技术

自20世纪70年代转基因生物和转基因产品被开发以来，转基因产品一直以迅猛的速度发展。据国际权威机构统计，全球由转基因作物加工生产的转基因食品和食品成份达近万种。其中作为食用油加工原料的大豆，油菜等占有较大比例，如大豆占全球转基因作物总种植面积的63％，油菜占5％。由于这些转基因油料作物出油率高，制油成本低，各发展中国家纷纷进口转基因大豆和油菜作为制油原料。

目前，尚缺乏科学依据证明转基因食用油对人类健康和环境的安全性，但市场调查显示了消费者对这一问题的关注。为保证消费者的健康权，知情权和选择权，各国政府明确规定了食用油必须进行市场标识。对转基因食品的检测，目前多采用PCR方法检测食品中是否含有插入的特定的外源基因。因此，食品中的DNA提取非常关键。由于食用油生产加工过程中经过高温和高压等处理过程，产品中的DNA遭到严重破坏，降解为长度较短，大小不一的片段，而且受物理，化学和生物等因素的影响，DNA的质量也大大降低，因此，食用油的DNA提取仍是国内外的难题之一。

食用油试剂盒目前在市场上做的不是很多，主要的原因是国内外没有一个比较稳定的DNA提取方法或试剂盒。我们的发明则能克服上述提取不稳定的缺陷。

发明内容

本发明采用了特殊的技术，旨在建立成熟稳定的、从植物来源原料加工而成的食用油中提取模板DNA的方法，用于转基因成分的PCR检测。

食用油加工工艺复杂，大都经过一系列的粉碎、高温等过程，DNA破坏极为严重，其DNA含量较低，DNA片段较小等等，都给食用油DNA提取带来非常大的困难，食用油DNA提取目前为国内外难题之一。本发明的目的就是解决现有食用油DNA提取技术的难题，提供一套独特的缓冲液系统，使适合于从植物源食用油中提取DNA，用于转基因成分的定性检测，以确保检测的稳定性和可靠性。

本方法针对植物源食用油经过高温高压的严酷条件加工后，其中水溶性的DNA分子含量极低、降解严重的特点，在进行DNA提取时，必须先将含量极低的水溶性成分从脂溶性油脂中充分分离出来，这是从油脂中提取DNA的一个关键；然后采用独特的提取缓冲液(提取缓冲液：100mM Tris.HCl，pH8.0；20mMEDTA；500mM NaCl；1.5％SDS(W/V)；4％PVP(W/V))和乙酸钠缓冲液(乙酸钠缓冲液：3M乙酸钠；11.5％冰乙酸(V/V))，在carrier RNA辅助下，经异丙醇沉淀，和用于富集DNA的第二次沉淀，经大离心管转移至小离心管，是进一步浓缩DNA分子的另一个关键。本方法有别于传统的CTAB裂解，酚/氯仿抽提，相较于传统方法一次操作需要几天的时间，该操作快速、便捷、安全，效率高、稳定性好，适合用于植物源食用油的转基因成分的定性检测。

本发明的技术路线概述如下：

(1)样品预处理：取食用油30ml，加入等体积乳化剂，于磁力搅拌器上搅拌2-3小时；

(2)取经预处理后的溶液10ml于大离心管中，加5ml提取缓冲液，涡旋振荡1分钟后，室温静置10分钟；

(3)加入2ml乙酸钠缓冲液，充分混匀，涡旋振荡1分钟后，室温静置10分钟；

(4)10,000rpm离心10分钟，将下层水相转移至新的大离心管中；

(5)向水相溶液中加入10μl Carrier RNA和0.7倍体积的异丙醇，充分混匀。(例如5ml的水相溶液加3.5ml异丙醇)，10,000rpm离心10分钟，弃上清，保留沉淀；

(6)向大离心管中加入700μl超纯水，涡旋振荡15秒，加入700μl异丙醇，涡旋振荡15秒，简短离心，将溶液转移到新的小离心管中；

(7)12,000rpm(～13,400×g)离心5分钟，弃上清；

(8)加入700μl70％乙醇，涡旋振荡5秒，12,000rpm(～13,400×g)离心5分钟，弃上清；

(9)开盖倒置，室温放置10min，彻底晾干残余的乙醇；

(10)加入40μl洗脱缓冲液TE，旋涡振荡1分钟，最终得到食用油DNA溶液。

根据本发明所阐述的方法，所用乳化剂为正己烷。

根据本发明所阐述的方法，所用提取缓冲液组成为：100mMTris.HCl，pH8.0；20mM EDTA；500mM NaCl；1.5％SDS(W/V)；4％PVP(W/V)。