[发明专利]微量临床样本中核酸的快速提取方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及各种临床样本中核酸的快速提取方法。更具体地，本发明涉及应用微量临床样本核酸快速提取装置从各种微量临床样本中快速处理和提取核酸的方法，包括细胞裂解、滤膜吸附和洗脱提取核酸(DNA和RNA)步骤。本发明还涉及用于临床样本核酸快速提取的试剂盒及其应用。

背景技术

(一)临床样本的前处理

临床常常需要从各种生物组织或细胞中抽提基因组DNA或RNA，应用核酸扩增技术测定其成分，这是用于病症的辅助性分析和诊断的一种高度敏感，且最为直接的检测手段。由于临床标本中含有蛋白质、脂类等物质，会干扰其下游扩增反应，故在进行检测反应前必须进行生物样本的处理和核酸提取。由于样本的处理及保存对DNA和RNA(尤其是RNA)的影响较大，因此在核酸标本的适当的预处理及保存对核酸模板的成功提取具有决定性作用。临床常见的标本有全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液等，这些临床标本的处理和保存方法各有不同。以下是不同临床标本的处理方法及步骤：

1.痰标本

痰属于分泌物，临床上常用作结核杆菌DNA测定样本，由于痰标本中含大量粘蛋白和杂质，故在核酸提取时，一定要对标本进行前处理，即用液化液去除粘蛋白，然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等经典法提取核酸。

2.棉拭子

用核酸扩增方法检测性病病原体时(衣原体、支原体、淋球菌、梅毒螺旋体、单纯性疱疹病毒、人乳头状瘤病毒等)，临床标本一般为棉拭子。现在应用的处理棉拭子具体方法为，用棉拭子取分泌物，置无菌试管或EP管内，在样本管中加无菌生理盐水，充分震荡混匀后离心，弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml，打匀的离心，重复洗涤一次，弃上清，沉淀即可用于核酸提取。

3.体液

体液标本，包括胸水、腹水、脑脊液、尿液等，可直接离心5分钟，取沉淀物提取核酸。

血性胸腹水，可加等体积红细胞裂解液，震荡混匀后离心，可根据情况重复2-3次，沉淀物用于核酸提取。

4.脓液

粘稠脓液：同痰标本处理，先将其液化，再离心取沉淀提取核酸。

水样脓液：直接离心，沉淀用生理盐水洗2-3次后用于核酸提取。

5.全血标本

通常用来提取外周血单个核细胞核酸：如基因组DNA、线粒体DNA、总RNA等。需要采用前处理，即加适量的红细胞裂解液(破膜液)，裂解全血中的红细胞；随后再加适量的细胞核裂液(破核液)，裂解白细胞中的细胞核，使核内核酸释放出来；最后再加SDS(十二烷基硫酸钠)等去污剂，溶解脂蛋白，解聚核蛋白。

(二)核酸提取

核酸提取已经成为了分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，但是目前核酸的提取方案纷繁浩渺。分子诊断市场的发展和测序市场、功能基因组计划的启动已经为核酸提取市场加足了油，传统的操作流程已经被更为简便和自动化的化学溶液代替，现在前市场上大部分核酸提取系统包括一个固体的纯化支持物，如离心柱里的薄膜，或者磁珠。有一些则设计成方便使用的微孔板的形式。

核酸在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，在核酸提取过程中应根据不同研究需要，保证核酸结构的相应完整性；尽量排除其它大分子成分(蛋白质、多糖等)的污染；和保证提取样本中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。表1是对几种DNA提取方法比较：

表1：各种DNA提取方法比较