[发明专利]一种5-[3-(生物素酰氨基己酰)-胺基]-丙烯基-2′-去氧-5′-三磷酸尿嘧啶核苷锂盐的合成工艺

说明书

所属技术领域 

本发明涉及一种的合成新工艺，属于生物医药诊断试剂的制备技术领域。 

背景技术

生物素标记的核苷三磷酸化合物在分子生物学和基因组学领域有着广泛的应用。本发明涉及5-[3-(生物素酰氨基己酰)-胺基]-丙烯基-2’-去氧-5’-三磷酸尿嘧啶核苷及其类似物的制备工艺。 

合成路线中最关键步骤为三磷酸化反应，Teréz Kovács等(TetrahedronLett.1988，29，4525-4528.Angew.Chew.Int.Ed.1998，37(20)，2872-2875.Nucleic AcidsResearch.2001，29(7)，1565-1573.)报道了三磷酸化反应条件，他们纯化分离产品的方法均采用Sephadex层析或者制备高压液相层析，严重限制了产品的大量制备，Wlassoff等(Bioconjugate Chem.1995，6，352-360.)报道了三磷酸锂盐的制备方法。 

张礼和等人(北京医科大学学报，1987，19(5)，334-336。北京医科大学学报，1990，22(3)，209-212。)使用的合成路线以2’-去氧-5’-三磷酸尿嘧啶核苷为起始原料，5位丙烯胺基取代以后与生物素酰氨基己酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯反应得到5-[3-(生物素酰氨基己酰)-胺基]-丙烯基-2’-去氧-5’-三磷酸尿嘧啶核苷，原料本身就不易得，再加上带有三磷酸根，在常温条件下稳定性都很差，所以反应都要尽可能在低温和短时间内完成，并且以后每一步反应物纯化均要Sephadex层析或者制备高压液相层析，同样限制了产品的大量制备。 

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种5-[3-(生物素酰氨基己酰)-胺基]-丙烯基-2’-去氧-5’-三磷酸尿嘧啶核苷及其类似物的合成和纯化方法，适用于大量合成。 

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：将图1所述化合物(a)和质子绵加入到单口瓶中，加入磷酸三甲酯溶解后为淡黄色溶液，氮气保护，冰浴控制温度在10℃以下，加入三氯氧磷后反应液立即由清澈变浑浊(粉色)，温度控制在10℃以下反应2-10hr后，加入焦磷酸三正丁胺盐的DMF溶液和三正丁胺的混合液，在低于10℃的温度下反应3min后加入碳酸三乙胺盐缓冲溶液终止反应，继续搅拌1hr后，真空旋干溶剂。将粗产品溶解在5～20ml氨水中，0～30℃温度下磁力搅拌反应2～20hr后真空旋干溶剂，加入10～30ml纯净水溶解，  二氯甲烷(30ml)萃取3遍，将水相真空旋干，得到的粗品通过柱层析，洗脱剂为丙醇，异丙醇，氨水，水按不同比例混合，纯化得到化合物2的纯品。 

将硼酸—硼酸钠缓冲溶液(pH8-10)加入到盛有化合物2的单口瓶中，0～25℃下加入生物素酰氨基己酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯的DMF溶液，0～25℃下反应，真空旋干溶剂，得到的粗品通过柱层析(洗脱剂为丙醇，异丙醇，氨水，水按不同比例混合)纯化得到纯品。 

将5-[3-(生物素酰氨基己酰)-胺基]-丙烯基-2’-去氧-5’-三磷酸尿嘧啶核苷溶解在水中，慢慢加入高氯酸锂的丙酮溶液，大量白色固体析出后，离心机离心分层后，取出上层清液，加入丙酮洗涤剩余固体，重复三次后，将固体常温真空抽干，得到最终白色固体产品，结构分别通过1HNMR，HPLC-MS得到验证。最终产品化学纯度大于95％。 

本发明所涉及的三磷酸化反应产物产品的纯化工艺包括但不仅限于上述化合物，可适用于通式化合物，如图2所示。 

其中：X：为氢、羟基等取代基团； 

Y：为氢、羟基等取代基团； 

R：5位取代的尿嘧啶或5位取代胞嘧啶等基团； 

R₁为H，Li，Na，K等。 

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。 

图1是5-[3-(生物素酰氨基己酰)-胺基]-丙烯基-2’-去氧-5’-三磷酸尿嘧啶核苷及其类似物的合成的工艺路线。 

图2是适用于本纯化工艺的三磷酸化反应产物通式。 

具体实施方式

1)图1中化合物(b)的制备