[发明专利]具有高纯度X-染色体和Y-染色体的精子群

说明书

本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/US01/15150，中国国家申请号为01810748.6，申请日为2001年5月9日，发明名称为“具有高纯度X—染色体和Y—染色体的精子群”。 

技术领域

分离的具有高纯度X—染色体或Y—染色体的精子群以及根据例如质量、体积、DNA含量等等区别特征分离精子、粒子、或事件的方法。 

背景技术

分离的具有高纯度X—染色体或Y—染色体的精子群可以被用于完成很多哺乳动物例如牛科动物、马科动物、羊科动物、山羊、猪、狗、猫、骆驼、大象、公牛、水牛等等的卵细胞或卵母细胞的体内或体外的授精或人工授精。另见，美国专利5,135,759，在此引入作为参考。 

但是，传统的将带有X—染色体和Y—染色体的精子群分离开的方法会产生低纯度的精子群。不论何种方法，精子—直都没有被分离成具有例如90％，95％，或大于95％的高纯度的X—染色体或Y染色体的精子样品。 

有关直接或间接根据大小、质量、或强度差异将带有Y—染色体的精子同带有X—染色体的精子分开的一些方法已经被公开。如美国专利号4,474,875所公开的，对所有精子细胞同时应用一种浮力而使分离培养基中带有X—染色体或Y—染色体的精子分离到不同的位置。美国专利号5,514,537公开了一种技术，其中精子穿过装有两种规格珠子的层析柱。带有大的X—染色体的精子被分离到含有大珠子的层中，而带有较小的Y—染色体的精子被分离到含有较小珠子的层中。美国专利No.4,605,558公开了可以使精子对密度梯度差分敏感的方法。而美国专利No.4,009,260 利用了带有X—染色体的精子和带有Y—染色体的精子在通过柱中阻碍介质的迁移速率或游动速率的差异。 

上面提到的每一项技术共同存在的问题是这些技术对精子以“大批量方式”起作用，意思是所有精子都在同一时间经受相同的处理，而带有Y—染色体的精子细胞比带有X—染色体的精子出来的更快更早，或处于不同的位置。这样，单个的精子细胞不能被鉴定并且不存在实际的体积、质量、密度或其它精子细胞特征的“量度”。逐个鉴定精子细胞在实际分离过程中所能带来的益处可以被检测到，并且甚至在分离过程中能够生成实物定量数据，和分离参数如所希望的发生变化。这些技术不能同流式细胞筛选装置一块使用。 

用于分离精子的流式细胞仪技术也已经被公开。利用这些技术时应当用荧光染色剂对精子染色并使其在一束狭窄的流或谱带—例如激光束一类的激发或照射源中流过。当被染色的颗粒或细胞经过激发或照射源时，荧光染色剂发出荧光。可以通过光学装置收集荧光，聚焦在象光电倍增管一类能够产生并倍增电信号的检测器上，然后用分析器进行分析。接着用多参数或单一参数的色谱图或直方图显示这些数据。可以用细胞的数目以及每个细胞的荧光作为坐标。见美国专利No.5,135,759，在此引入作为参考。但是，针对这类技术仍然有大量没有解决的问题并且分离高纯度的带有X—染色体或Y—染色体的精子细胞是困难的。 

传统的流式细胞仪技术的一个显著问题是鞘液中的物质、颗粒、或者细胞的定向。当物质或者细胞相对于超过一个轴—例如精子—而使得形状不规则时候，这尤其成为问题。这一问题的一个方面应当是在鞘液中建立物质的初始取向。这一问题的第二个方面是在被测物质发光期间保持物体相对于检测器(光电倍增管或其它类似的仪器)的取向。 

传统的流式细胞仪技术的另一个显著问题是不能将物质或细胞包裹在液滴中。尤其是，当在不规则形状物体的周围形成液滴时，液滴的大小不足以完全覆盖物质或细胞的所有部分。例如，在流式细胞仪作用期间，如上所述的液滴能够以很快的速度形成，甚至每秒10,000到90,000之多，在有些情况下每秒80,000个之多。当精子被包封在液滴中时，特 别是以这样快的速率，精子的尾部或颈部的一部分没有被包封在液滴中。没有被包封在液滴中的尾和颈的那部分会以某种干扰后面液滴形成或液滴正确偏转的方式与喷嘴或液滴的周围环境起反应。因此有些精子根本没有被分析到从而降低了这一方法的效率，或者没有被被消除到足以赋值给一个细胞群，或者偏离正常轨道，或者全部情况的组合发生。