[发明专利]一种溶胶凝胶包埋固定化酶制备S型环戊烯酮的方法

说明书

技术领域

本发明涉及手性化合物的制备方法，尤其涉及一种溶胶凝胶包埋固定化酶制备S型环戊烯酮的方法。

背景技术

烯丙醇酮及炔丙醇酮是拟除虫菊酯类杀虫剂的重要中间体。拟除虫菊酯是一种新型高效的卫生用杀虫剂，共有八种光学对映体，其中S型烯丙醇酮或S型炔丙醇酮的反式菊酸酯的生物活性最强，因此为了减少施药量，避免不必要的环境污染，获得光学纯的烯丙醇酮是合成高活性菊酯的关键步骤。由于脂肪酶能够特异性地在油水界面上发挥催化活性，并且反应条件温和，催化稳定性高、区域和立体选择性强，因此被广泛应用于有机合成及光学化合物的手性拆分中。例如，Danda等人采用酶法水解与化学法构型反转相结合的方法制备S型烯丙醇酮，最终产率达到80％，产物的ee值为78％(Danda H；Nagatomi T；，Maehara A；Umemura T，Tetrahedron(1991)，47：8701-8716)。此外，一种经表面活性剂修饰的高活性的脂肪酶Pseudomonas sp.也被用于手性烯丙醇酮的制备，其所得的S型烯丙醇酮ee接近100％，然而，在该报道中，没有报道该脂肪酶的稳定性情况(Wu HY；Xu JH；Tsang SF，Enzyme Microb Technol(2004)34：523—528)。在我们实验室，我们曾采用表面修饰的疏水硅藻土为载体采用多种方法对脂肪酶Arthrobacter sp.进行固定化并将其用于烯丙醇酮的转酯化拆分反应，其结果表明，采用基于界面吸附的酶聚集体包覆法所制备的固定化酶其酶活力和稳定性最高，在重复利用十次后，残余酶活仍为初始酶活的85％以上(Yang G；Wu JP；Xu G；Yang LR，J Mol Catal B：Enzym(2008)已发表未出版)。

为了获得更高稳定性的固定化酶，在此，我们将尝试溶胶凝胶法对酶进行固定化。近年来，溶胶凝胶包埋法被广泛应用于生物活性物质的固定化。该法一般是用含高化学活性组分的化合物作前驱体，在液相下将这些原料均匀混合，并进行水解、缩合化学反应，在溶液中形成稳定的透明溶胶体系，溶胶经陈化、聚合后，形成三维空间网络结构的凝胶。采用这种方法包埋生物分子，具有适用范围广、生物活性物质活性和稳定性高，以及材料性质(如孔径等)可控等优点。目前，尚无溶胶凝胶法固定化脂肪酶应用于烯丙醇酮或炔丙醇酮转酯化拆分的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种溶胶凝胶包埋固定化酶制备S型环戊烯酮的方法。

包括如下步骤：

1)在总体积为1ml的有机硅烷前驱体中，加入0.5ml的去离子水，30μl的0.1mol/l的盐酸或氢氧化钠溶液，并在200～250rpm，0～10℃条件搅拌30min，形成均匀的溶胶；

2)向溶胶中加入含有0.005～0.02g脂肪酶的缓冲液，缓冲液的浓度为0.03M，pH7.0～9.0，缓冲液用量为0.5～1ml；搅拌10～20min后，在100rpm条件下继续搅拌1～3h；在4～10℃条件下静置老化过夜，于25～35℃条件下真空干燥7～10天，研磨，得到包埋固定化脂肪酶；

3)将浓度为0.1～3mol/L的环戊烯酮、浓度为2～10mol/L的酰基供体、体积为5～10ml的溶剂混合，加入25mg的包埋固定化脂肪酶在转速为200～250rpm的摇床中进行反应；反应温度为30～50℃，得到S型环戊烯酮。

所述的脂肪酶为：Pseudomonas aeruginosa、Arthrobacter sp.或Acinetobactersp.。有机硅烷前驱体为：甲基三甲氧基硅烷、丙基三甲氧基硅烷、丁基三甲氧基硅烷、辛基三甲氧基硅烷、γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷或γ-甲基丙烯酰氧丙基甲基二甲氧基硅烷，或者上述一种与正硅酸甲酯或正硅酸乙酯的混合物，其摩尔比1：3～3：1。溶剂为：乙腈、异丙醚、甲苯或乙酸乙烯酯。酰基供体为：乙酸乙烯酯、醋酸异丙烯酯或乙酸酐。

本发明将固定化酶应用于在环戊烯酮的对映体拆分反应中，活力及稳定性，包括热稳定性、操作稳定性等均有显著提高。

附图说明

图1为溶胶凝胶包埋固定化酶1#和游离酶在30～60℃范围内保存于有机溶剂乙酸乙烯酯中16小时后的残余酶活力比较；

图2为溶胶凝胶包埋固定化酶1#和游离酶重复利用情况比较。

具体实施方式

实施例1