[发明专利]苹果多酚氧化酶的提取及测定方法

说明书

技术领域

本发明是关于苹果多酚氧化酶的提取和测定方法，属于天然药物领域。

背景技术

酶促褐变是果蔬加工过程中普遍存在的一种现象。酶促反应的发生不仅影响产品的外观品质，同时营养成分及风味也会发生很大的变化，使产品质量下降，影响到产品的销售和企业经济效益。尤其是发生在肉质颜色较浅的水果、蔬菜上的酶促褐变更为显著。在热带鲜果中，酶促褐变导致的直接经济损失达50％。

酶促褐变反应非常迅速，甚至在极短的时间内便可发生。酶促褐变产生的原因主要是当果蔬受到机械损伤或处于不良环境，如受冻、受热时，尤其是在加工过程中，果蔬内的多酚类物质在多酚氧化酶的催化作用下氧化而呈现褐色。这些多酚类物质包括邻苯二酚(儿茶酚)、绿原酸、咖啡酸、没食子酸等，它们在完整的细胞中作为呼吸传递物质，在酚-醌之间保持着动态平衡。当新鲜的果蔬组织被损伤，氧大量侵入，酶原被激活，邻苯二酚类物质经酶的催化作用氧化为邻苯醌类化合物，该化合物进一步聚合形成复杂聚合物：黑素(melanin)。

酶促褐变反应的发生必须具备三个条件：多酚类物质、多酚氧化酶和氧。决定酶促褐变率的最重要的因素即为组织中活性多酚氧化酶和酚类化合物的浓度、可利用的氧含量、pH值和温度等。

多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，简称PPO)的系统命名是邻二酚：氧-氧化还原酶，广泛分布于自然界。多酚氧化酶是一种含铜的酶，必需以氧为受氢体，是一种末端氧化酶。人们普遍认为多酚氧化酶是两种酶的复合体：(1)酚羟化酶，又叫甲酚酶(cresolase)。催化一元酚羟基化反应，生成相应的邻一二羟基化合物。(2)多元酚氧化酶，又叫儿茶酚酶(catecholase)。催化邻-二酚氧化，生成邻-醌。以上两类反应都需要有分子氧的参加。由果蔬酶促褐变产生的机理可知，抑制酶促褐变可从三方面人手：(1)减少多酚类物质的含量；(2)控制多酚氧化酶的活性；(3)降低氧浓度，从而控制褐变的发生。

果蔬的酶促褐变主要是由于多酚氧化酶催化酚类物质氧化而造成的。

世界苹果年产量约为3,200万公吨。美国所产的苹果通常有一半鲜食；约1/5用以制醋、果汁、果冻、苹果泥等；约1/6做成罐装苹果酱及用作馅饼原料。在欧洲，很大部分苹果用制苹果酒和白兰地。用制苹果酒的苹果占世界产量的1/4。美国、中国、法国、意大利和土耳其是最大的生产国，法国、义大利、匈牙利、阿根廷、智利、南非和美国是最大的输出国。苹果富含碳水化合物和维生素A、C，所含纤维量多，亦为身体所必需。1.苹果中的胶质和微量元素铬能保持血糖的稳定，还能有效地降低胆固醇；2.在空气污染的环境中，多吃苹果可改善呼吸系统和肺功能，保护肺部免受污染和烟尘的影响；3.苹果中含的多酚及黄酮类天然化学抗氧化物质，可以减少肺癌的危险，预防铅中毒；4.苹果特有的香味可以缓解压力过大造成的不良情绪，还有提神醒脑的功效；5.苹果中富含粗纤维，可促进肠胃蠕动，协助人体顺利排出废物，减少有害物质对皮肤的危害；6.苹果中含有大量的镁、硫、铁，铜、碘、锰、锌等微量元素，可使皮肤腻、润滑、红润有光泽。

苹果营养丰富，是人们非常喜爱的水果之一。苹果中富含多酚类物质和多酚氧化酶，在苹果的保鲜过程中，多酚氧化酶能催化酚类物质氧化发生酶促褐变反应，使苹果的品质发生变化。如果能将苹果中的多酚氧化酶提取出来，那么对于高浓度苹果汁、苹果酱、苹果酒等苹果加工产品的生产将具有重要意义。在本发明完成之前，未发现有对苹果多酚氧化酶提取并测定的报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种苹果多酚氧化酶的提取测定方法。

本发明的目的之二是为果蔬类产品的保鲜技术的开发提供一些资料。

本发明的技术解决方案如下：

1.多酚氧化酶(polyphenol oxidase，简称PPO)的提取

苹果洗净后在低温下保温，再去皮去核后取其果肉，立即加入冷丙酮，用高速组织捣碎机匀浆2min，而后用布氏漏斗抽滤滤饼用前一次1/2量的冷冻丙酮再次提取抽滤，得到的白色物质冷冻真空干燥，即得PPO丙酮粉。

称取丙酮粉，溶于的预冷磷酸盐缓冲溶液中，用磁力搅拌器搅拌离心，上清液过滤，即得苹果PPO粗酶液。

2.多酚氧化酶测定方法

在1ml磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液中，用1ml0.1mol/L邻苯二酚为底物，加1ml酶提取液，反应3min后，在分光光度仪扫描并观察吸收峰情况。测定时以水为空白，以热失活的粗酶液代替粗酶液在同样条件下测定为对照。

3.PPO活性的测定