[发明专利]苹果多酚氧化酶的提取及测定方法

权利要求书

1.苹果多酚氧化酶的提取及测定方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)多酚氧化酶(简称PPO)的提取

苹果洗净后在低温下保温，再去皮去核后取其果肉，立即加入冷丙酮，用高速组织捣碎机匀浆2min，而后用布氏漏斗抽滤滤饼用前一次1/2量的冷冻丙酮再次提取抽滤，得到的白色物质冷冻真空干燥，即得PPO丙酮粉。

称取丙酮粉，溶于的预冷磷酸盐缓冲溶液中，用磁力搅拌器搅拌离心，上清液过滤，即得苹果PPO粗酶液。

(2)多酚氧化酶测定方法

在1ml磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液中，用1ml0.1mol/L邻苯二酚为底物，加1ml酶提取液，反应3min后，在分光光度仪扫描并观察吸收峰情况。测定时以水为空白，以热失活的粗酶液代替粗酶液在同样条件下测定为对照。

(3)PPO活性的测定

取磷酸盐缓冲溶液1ml于1cm比色皿中，加人0.1mol/L邻苯二酚溶液1ml。混匀后在400mm处比色，从酶液加入后开始记时，每15s记录一次OD随时间的变化值，以最初直线段的斜率(ΔOD/t)表求酶活力，一个酶活力单位(U)定义为：在测定条件下，每分钟引起吸光度改变0.001所需的酶量。

2.根据权利1中所述的苹果洗净后在低温下保温，再去皮去核后取其果肉，立即加入冷丙酮，其特征在于：苹果的保温温度为4℃，保温时间为4h；加入冷丙酮的量为：7ml/g苹果。

3.根据权利1中所述的称取丙酮粉，溶于的预冷磷酸盐缓冲溶液中，其特征在于：磷酸缓冲液(m)∶丙酮粉(v)＝100∶1，浓度为0.05mol/L，pH 6.8，温度4℃，且包含有含2％的PVPP(聚己烯吡咯烷酮)和0.25％Triton X100。

4.根据权利1中所述的用磁力搅拌器搅拌离心，上清液过滤，其特征在于：搅拌时间20min，速率5000r/min，离心10min。

5.根据权利1中所述的在分光光度仪扫描并观察吸收峰情况，其特征在于：分光光度计的扫描波长为300-450nm。