[发明专利]四环素与载体蛋白偶联产物和四环素类抗生素抗体制备的方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于免疫化学生物技术领域，尤其是涉及一种四环素与载体蛋白偶联产物和四环素类抗生素抗体制备的方法及用途。

背景技术

关于药物残留的控制既需要完善的检验方法和标准，又需要健全的监控体系。目前国际上对抗生素类药物残留的检测主要有仪器分析法(包括HPLC和GC-MS)和微生物学法(主要用于抗生素残留的检测)等。仪器分析法既要求仪器设备具有相当高的精度，也要求技术人员具有较好的分析操作技能，其昂贵的价格和缓慢的软件更新速度以及操作上的烦琐限制了其在一般实验室中的应用。但由于检测的灵敏度可以达到ng级水平(ppb级)，在一些大型实验室仍将其作为残留检测的参考标准使用。

四环素类抗生素在畜牧业中的滥用导致动物体内药物的滞留或蓄积，并以残留的方式进入人体及生态系统。它对人体及环境的危害主要是慢性、远期和累积性的。四环素可与新形成的骨、牙中所沉积的钙相结合。妊娠5个月以上的妇女服用这类抗生素时，出生的幼儿乳牙可出现荧光、变色、牙釉质发育不全，畸形和生长抑制。幼儿，尤其是出生后第1年，由于肾发育不全，药物不能充分排泄，即使短期用药，也极易引起乳牙的色素沉着和牙釉质发育不全，易于造成龋齿，牙染色由黄转为棕黄。剂量越大，黄染越深，牙釉质发育不全也更加显著。四环素引起恶心、呕吐、上腹部不适、腹胀、腹泻等。长期用四环素后，使正常菌群的分布发生改变，敏感菌受到抑制，耐药细菌、真菌(主要是白色念珠菌)等乘机在体内繁殖，发生消化道、呼吸道和泌尿道等感染。在长期的生活中，恰恰是人类和动物肠道的正常菌群成了耐药基因的储存库，并不断的将耐药基因转移给致病菌，并在人和动物中交叉传播，尤其是释放到环境中耐药菌的危害更为严重，可造成耐药基因的迅速转移。随着人们生活水平以及对滥用抗生素危害性认识的提高，人们非常重视食品中抗生素的残留，喜欢食用无抗生素残留的畜产品和水产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种四环素与载体蛋白偶联产物和四环素类抗生素抗体制备的方法及用途。

四环素与载体蛋白偶联产物的制备方法包括如下步骤：

a)将5-1000mg的四环素盐酸盐溶解于1-20ml超纯水中；

b)10-3000mg的载体蛋白溶解于1-110ml的0.1-0.2M pH3-6的醋酸钠缓冲溶液中；

c)将上述两种溶液混匀后，在搅拌状态下逐滴加入25％的甲醛10-3000ul，加毕后在10-35℃下避光搅拌反应1-48小时，合成四环素-载体蛋白偶联产物；

d)四环素-载体蛋白偶联产物放入透析袋中，用0.01M pH7.2的磷酸盐缓冲液在4℃透析1-3天；

e)透析后的四环素-载体蛋白偶联产物进行紫外扫描，分析鉴定偶联产物及浓度测定，分装后于-20℃冰箱保存备用。

所述的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙种球蛋白、酶或卵清蛋白。

所述的四环素-载体蛋白偶联产物可免疫动物制备四环素类抗生素抗体及作为人工抗原应用于食品中四环素类抗生素检测的免疫学方法。

抗四环素类抗生素单抗的制备方法包括如下步骤：

1)四环素-载体蛋白偶联产物作为免疫原免疫BALB/C小鼠；

2)取免疫鼠的脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇融合剂下融合，HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法筛选分泌抗四环素抗体的细胞；

3)采用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗四环素类抗生素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株；杂交瘤细胞注射入BALB/C小鼠腹腔制备单抗腹水；

4)采用直接竞争ELISA方法测定抗四环素类抗生素单抗与土霉素、金霉素、链霉素、卡那霉素、青霉素、庆大霉素、氯霉素的交叉反应率，选择仅与四环素类抗生素有特异性免疫反应，且检测灵敏度达到0.5-3ng/mL的单抗，可用于畜产品中四环素类抗生素残留的检测。

所述的免疫原是根据权利要求书1方法偶联的四环素-载体蛋白偶联产物。

所述的免疫原的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙种球蛋白、酶或卵清蛋白。

抗四环素类抗生素单抗用于检测食品中四环素类抗生素残留的免疫学方法。所述的用于检测食品中四环素类抗生素残留的免疫学方法为竞争ELISA或免疫检测试纸条。

四环素-载体蛋白偶联产物免疫鼠、兔子、羊、驴、牛或禽制备抗四环素类抗生素多抗的制备方法包括如下步骤：