[发明专利]四环素与载体蛋白偶联产物和四环素类抗生素抗体制备的方法及用途

权利要求书

1.一种四环素与载体蛋白偶联产物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

a)将5-1000mg的四环素盐酸盐溶解于1-20ml超纯水中；

b)10-3000mg的载体蛋白溶解于1-110ml的0.1-0.2M pH3-6的醋酸钠缓冲溶液中；

c)将上述两种溶液混匀后，在搅拌状态下逐滴加入25％的甲醛10-3000ul，加毕后在10-35℃下避光搅拌反应1-48小时，合成四环素-载体蛋白偶联产物；

d)四环素-载体蛋白偶联产物放入透析袋中，用0.01MpH7.2的磷酸盐缓冲液在4℃透析1-3天；

e)透析后的四环素-载体蛋白偶联产物进行紫外扫描，分析鉴定偶联产物及浓度测定，分装后于-20℃冰箱保存备用。

2.根据权利要求1所述一种四环素与载体蛋白偶联产物的制备方法，其特征在于所述的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙种球蛋白、酶或卵清蛋白。

3.一种如权利要求1所述方法制备的四环素与载体蛋白偶联产物的用途，其特征在于所述的四环素-载体蛋白偶联产物可免疫动物制备四环素类抗生素抗体及作为人工抗原应用于食品中四环素检测的免疫学方法。

4.一种抗四环素类抗生素单抗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)四环素-载体蛋白偶联产物作为免疫原免疫BALB/C小鼠；

2)取免疫鼠的脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇融合剂下融合，HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法筛选分泌抗四环素类抗生素抗体的细胞；

3)采用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗四环素类抗生素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞注射入BALB/C小鼠腹腔制备单抗腹水；

4)采用直接竞争ELISA方法测定抗四环素类抗生素单抗与土霉素、金霉素、链霉素、卡那霉素、青霉素、庆大霉素、氯霉素的交叉反应率，选择仅与四环素类抗生素有特异性免疫反应，且检测灵敏度达到0.5-3ng/mL的单抗。

5.根据权利要求4所述的一种抗四环素类抗生素单抗的制备方法，其特征在于所述的免疫原是根据权利要求1方法偶联的四环素-载体蛋白偶联产物。

6.根据权利要求4所述的一种抗四环素类抗生素单抗的制备方法，其特征在于所述的免疫原的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙种球蛋白、酶或卵清蛋白。

7.一种如权利要求4所述方法制备的抗四环素类抗生素单抗的用途，其特征在于，四环素单抗用于检测食品中四环素类抗生素残留的免疫学方法。

8.根据权利要求7所述的一种四环素类抗生素单抗的用途，其特征在于所述的用于检测食品中四环素类抗生素残留的免疫学方法为竞争ELISA或免疫检测试纸条。

9.一种用权利要求1所述方法制备的偶联产物免疫鼠、兔子、羊、驴、牛或禽制备抗四环素类抗生素多抗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)初次免疫采用0.1-5mg偶联产物抗原与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后皮下或皮内或肌肉小量、多点注射免疫；

2)每间隙2-4周，用弗氏不完全佐剂与偶联产物抗原充分乳化后皮下或皮内或肌肉小量、多点注射，进行2-5加强免疫；

3)末免不加佐剂，加倍剂量肌肉注射免疫，末免后7-10天后采血，离心分离血清；

4)用蛋白A/G亲和柱纯化IgG，纯化的IgG冻干冰箱保存。