[发明专利]牙鲆弹状病毒的快速检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于水产动物病原的检测技术，具体是一种采用环介导等温扩增技术对鱼类牙鲆弹状病毒进行快速检测的试剂盒及其检测方法。

背景技术

牙鲆弹状病毒(Hirame rhabdovirus，简称HRV)病毒粒子呈枪弹形，大小为80nm×160-180nm，1986年日本首次报道。我国黄海、渤海近岸等地养殖的牙鲆已被发现有此病症。发病季节为冬季和早春，鱼体发病时，水温一般都在15℃以下。本病主要危害牙鲆，人工感染对真鲷、黑鲷有强烈的致病性，从香鱼和无备平鮋中也分离到此病毒，对虹鳟也有致病作用。幼苗期和仔鱼期的鱼体易患此病。感染牙鲆弹状病毒的病鱼体表和鳍充血或出血，腹部膨胀，内有腹水。解剖鱼体，肌肉、肠黏膜的固有层出血，生殖腺的结缔组织充血或出血。鉴于牙鲆弹状病毒的严重危害性，中国国家质量监督检验检疫总局与韩国海洋水产部于2005年发布的《中韩进出口活水生动物检验检疫协议》中规定，我国出口到韩国的鲈鱼、真鲷、大菱鲆、牙鲆等鱼类必须进行牙鲆弹状病毒的检验检疫，以防止牙鲆弹状病毒传播蔓延，给本国的水产养殖业造成损失。因此，迫切需要建立快速、灵敏、准确的牙鲆弹状病毒的检测方法，打破国外技术壁垒，为国家贸易服务。

目前鱼类病毒的检测方法主要包括细胞学诊断技术、免疫学诊断技术、分子生物学诊断技术三大类。细胞学诊断技术主要包括采用细胞培养分离病毒、组织病理切片及电镜观察，其操作繁琐，检测周期长，且灵敏度低；免疫学诊断技术主要包括免疫荧光检测、免疫点杂交，其方法具有特异性强、敏感性高的优点，但方法相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测；分子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)，比较快速、灵敏，但是需要昂贵的PCR仪器，另外需要琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色观察结果，溴化乙锭是致癌物，对人体和环境有危害，交叉污染问题比较严重。

环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，简称LAMP)技术，是一种敏感性高、特异性强的靶DNA快速检测方法，不需要昂贵的仪器，样品中含有少量的病原就能检出。环介导等温扩增目前已被广泛应用于检测水产动物病原，如鱼类病毒(鲤春血症病毒、传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、锦鲤疱疹病毒)、对虾病毒(对虾白斑综合症病毒、黄头病毒)、细菌(迟钝爱德华氏菌)等。据检索，目前尚未见采用环介导等温扩增技术对牙鲆弹状病毒进行快速检测的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用环介导等温扩增技术检测牙鲆弹状病毒的检测试剂盒，克服现有技术的不足，以满足现场即时检测的要求。

本发明的另一目的是提供这种检测试剂盒的检测方法，以方便在水产养殖业和国际鱼类贸易中对牙鲆弹状病毒进行快速检测中的应用。

本发明的主要原理为：LAMP技术是使核酸通过在等温环境中的循环置换扩增实现对靶序列的放大，从而达到检测的目的。基本程序是针对靶基因的6个区域，设计2对特异性引物，同时可以设计1-2条环引物以加快反应速度，利用一种链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bacillus stearothermophilus DNApolymerase，简称Bst DNA聚合酶)，在恒温65℃左右反应约1h。Bst DNA聚合酶有两大特性：一是具有5′-3′聚合酶活性，能在恒温状态下扩增DNA核酸；二是Bst DNA聚合酶具有链置换活性，能将新合成的核酸单链从新生成的DNA双链上置换(取代)下来，形成两条独立的核酸单链以开启下一轮的DNA核酸合成，进而免去了每次扩增前的DNA变性环节。LAMP反应过程中，一对引物的5′端含有一段与下游扩增产物互补的序列，因此，这对引物的单链产物就可形成一个类似哑铃状的回文结构，这种结构正好为下一步等温置换扩增反应提供了一个可被周而复始利用的模板，Bst DNA聚合酶发挥链置换活性，后阶段退火的引物置换前面引物所形成的链，从而保证了扩增的持续进行LAMP反应形成一系列不同长度的具有茎环结构的DNA产物，可以通过荧光染料进行检测。

本发明的技术方案如下：

牙鲆弹状病毒的环介导等温扩增快速检测试剂盒，包括提供反应必须的Bst DNA聚合酶、逆转录酶、反应缓冲液、环介导等温扩增混合液、引物混合液和荧光显色剂，以及提供一种使用该试剂盒检测鱼类样品中牙鲆弹状病毒的方法，以实现对牙鲆弹状病毒快速检测的标准化，为鱼类牙鲆弹状病毒的检测提供一种快速、简便、高效、实用的检测方法。

本发明的牙鲆弹状病毒的环介导等温扩增快速检测试剂盒的配方如下：

试剂A：Bst DNA聚合酶(8U/μL)；