[发明专利]一种基因工程抗菌肽及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型的基因工程抗菌肽的制备，属于现代农业技术中的生物工程药物生产技术领域。

背景技术

抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。世界上第一个被发现的抗菌肽是1980年由瑞典科学家G.Boman等人经注射阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生的具有抗菌活性的多肽，定名为Cecropins。此后数年间，人们相继从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物乃至人类中发现并分离获得具有抗菌活性的多肽。由于最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为″antibactetial peptides，ABP″，中文译为抗菌肽，其原意为抗细菌肽。随着人们研究工作的深入开展，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用，因而对这类活性多肽的命名许多学者倾向于称之为″peptide antibiotics″——多肽抗生素。但由于几乎所有的多肽抗生素均具有抗细菌的功能，因而抗菌肽作为一个约定俗成的名称在国内依然被广泛采用。

抗生素的滥用不仅导致了药物残留等公共卫生隐疾，而且由于耐药菌株的出现，使得细菌性疾病的防治再次成为困扰人类的难题。一种全新的抗菌药物的开发已经成为当代微生物学家、医药学家和兽医工作者的主攻课题。抗菌肽由于其广谱高效抗菌活性及独特的抗菌机制而在新型抗菌药物研究中显露明显优势。特别是对抗菌肽作用机制及其基因表达调控机制认为的不断深化，结合现代基因工程技术，将可设计出在医药工业和畜牧业上更有效的抗菌肽，更是引起研究人员的广泛关注。按照中国农业部规定，有多种抗生素被禁用或限用，对传统的畜牧养殖业造成了重大冲击，作为抗生素的良好替代药物抗菌肽的使用将是大势所趋。

目前，开发抗菌肽较为成功的是美国的Helix BioMedix公司和加拿大IntraBiotics制药公司对基因工程抗菌肽进行合理的改造和突变，进一步增加其抑菌和杀菌活性，研究其作用机制、以及结构和功能的关系对畜牧业和抗生素生产具有指导意义。

LL-37是迄今为止发现的唯一一种存在于人体的Cathelicidin类抗菌肽，是由其前体肽Human cathelicidin antimicrobial peptide18(hCAP-18)经丝氨酸蛋白酶3和其他蛋白水解酶酶解后释放出的有活性的C端片段。体外实验证LL-37具有广谱抗菌作用，抗菌活性依赖其螺旋构象的形成，通过“地毯样”机制杀灭细菌。LL-37除了直接杀菌作用外，还具有抗肿瘤、结合与中和内毒素、趋化及促进血管生成等作用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种新型基因工程抗菌肽及其制备方法。

发明概述

本发明根据现有的抗菌肽Magainin，Cecropin P与LL-37的氨基酸序列的特点，设计了新的抗菌肽基因，合成其序列转化于毕赤酵母中表达，形成了抗菌肽基因转化毕赤酵母工程菌，在发酵罐中表达，达到高密度培养和高效表达的效果。将发酵液分离纯化成为抗菌肽制品。

发明详述

本发明的技术方案如下：

一、基因工程抗菌肽

本发明的基因工程抗菌肽，具有如下序列：

GCTCTC  6

GAGAAAAGAG GTATTGGTAA GTTTTTGCAT TCTGCTAAGA AGTTTGGTAA GGCTTTTGTT 66

GGTGAGATTA TGAACTCTGA GAAAAGATCT TGGTTGTCTA AAACTGCTAA AAAATTGGAA 126

AATTCTGCTA AAAAGCGTAT TTCTGAAGGT ATTGCTATTG CTATTCAAGG TGGTCCACGT 186

GAGAAAAGAT TGTTGGGTGA CTTCTTCAGA AAGTCCAAGG AAAAGATCGG TAAGGAGTTC 246

AAGAGAATCG TCCAGAGAAT CAAGGACTTC TTGAGGAACT TGGTCCCAAG AACTGAATCC 306

CAATGATCTA GAAGT                                                 321

二、基因工程抗菌肽的制备

本发明的基因工程抗菌肽的制备方法，步骤如下：

1)合成抗菌肽基因