[发明专利]一种基因工程抗菌肽及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种基因工程抗菌肽，其特征是，由如下核苷酸序列编码：

                                                           GCTCTC    6

GAGAAAAGAG GTATTGGTAA GTTTTTGCAT TCTGCTAAGA AGTTTGGTAA GGCTTTTGTT    66

GGTGAGATTA TGAACTCTGA GAAAAGATCT TGGTTGTCTA AAACTGCTAA AAAATTGGAA    126

AATTCTGCTA AAAAGCGTAT TTCTGAAGGT ATTGCTATTG CTATTCAAGG TGGTCCACGT    186

GAGAAAAGAT TGTTGGGTGA CTTCTTCAGA AAGTCCAAGG AAAAGATCGG TAAGGAGTTC    246

AAGAGAATCG TCCAGAGAAT CAAGGACTTC TTGAGGAACT TGGTCCCAAG AACTGAATCC    306

CAATGATCTA GAAGT                                                     321。

2.权利要求1的基因工程抗菌肽的制备方法，步骤如下：

1)合成抗菌肽基因

根据GenBank中三个抗菌肽Magainin、Cecropin P和LL-37的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，设计6条引物M1，M2，C1，C2，L1和L2；在M2与C1、C2与L1引物间有20bp的互补序列，其中M1引物5′端加入Xho I酶切位点及酵母的Kex2酶裂解位点序列，L2引物5′端加入Xba I酶切位点；在该三个抗菌肽序列间加入酵母的Kex2酶裂解位点序列，基因末端引入谷氨酰胺，同时，合成毕赤酵母通用引物5’AOX和3’AOX作为鉴定引物，进行SOE法PCR扩增；

XhoI

M1：5’-GCT AAAAGAGGTATTGGTAAGTTTTTGCATTCTGCTAAGAAGTTTGG-3’

M2：5’-CTCAGAGTTCATAATCTCACCAACAAAAGCCTTACCAAACTTCTTAGCAGAATG-3’

C1：5’-GAGATTATGAACTCTGAGAAAAGATCTTGGTTGTC-3’

C2：5’-ACCCAACAATCTTTTCTCACGTGGACCACCTTGAATAGC-3’

L1：5’-GAGAAAAGATTGTTGGGTGACTTCTTCAGAAAGTCC-3’

XbaI

L2：5’-ACT TCATTGGGATTCAGTTCTTGGGACCAAGTTCCTCAAGAAGTC-3’

5’AOX：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’

3’AOX：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’

2)将上述PCR产物回收后直接进行Xho I、Xba I双酶切，定向插入酵母表达载体pPICZα-A中，构建重组酵母表达质粒；用EcoR I酶切位点缺失法和PCR法鉴定阳性质粒，鉴定的阳性质粒命名为pPICZa-mcl并进行测序；

3)感受态毕赤酵母菌X-33 80uL与Sac I线性化的重组表达载体10uL相混合，转移到预冷的0.2cm的石英电转杯中，对感受态酵母菌X-33进行电击转化，得转化物；取0.1mL转化物均匀涂布于含100μg/mL Zeocin^TM素的YPDS选择平板上，30℃培养至有高拷贝重组菌株取单菌落出现；

采用PCR技术检测mcl基因与毕赤酵母基因组的整合、筛选阳性克隆；得阳性重组子，即为抗菌肽酵母菌；

4)将步骤3)筛选到的阳性重组子接种于5mL含100μg/m1Zeocin^TM的YPDS液体 培养基中，28-30℃220-300r/min培养过夜，次日按1∶50的比例转接于100mLBMGY培养基，28-30℃220-300r/min培养至A600达到3～6，离心收集菌体重悬于500mL BMMY培养基，进行诱导表达；28-30℃，220-300r/min培养48-72h；48-72h后，8000-12000r/min离心10min收集培养上清，进行抑菌活性测定。