[发明专利]高耐性酿酒酵母工程菌及其构建方法

说明书

【技术领域】：本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物育种的方法，尤其是一种耐高温和耐高酒精浓度的酿酒酵母工程菌及其制备方法。

【背景技术】：酒精浓醪发酵可提高设备利用率、降低蒸馏能耗和生产成本。然而高浓度酒精对酵母菌的生长、发酵和存活都具有毒害作用，因此发酵终点的酒精浓度与酵母菌本身的耐酒精性能有关。普通酿酒酵母的酒精发酵浓度为12％(V)左右，如能将酒精发酵的浓度提高至16％(V)，则可节省蒸馏能耗25％左右。此外，普通酿酒酵母发酵的最适温度为32℃左右，当温度超过35℃时，酵母菌的生长和发酵能力大大减弱。如果能提高酵母对温度的耐受性，则可适当提高发酵温度，加快发酵速度，减少酒精发酵过程中冷却水的消耗量。综上所述，在酒精发酵时，有必要选用耐高温和耐高酒精浓度的酵母菌。

许多研究都表明，海藻糖不仅是酿酒酵母细胞内的一种重要贮藏性碳源，而且可以作为酵母细胞的活性保护物质。在一些极端环境(冷冻、干燥、热处理等)下，酵母细胞可以通过调节海藻糖的合成来抵御外界的不良伤害，所以海藻糖含量被认为是酵母耐性的重要鉴定指标。但当环境条件恢复的情况下，胞内海藻糖又会迅速分解。所以如何降低胞内海藻糖的消耗速率是提高酵母耐性的有效途径。海藻糖的分解由两类海藻糖酶(Trehalase)调控，中性海藻糖酶(NTH，由nth1和nth2基因编码)和酸性海藻糖酶(ATH，由ath1基因编码)。现在的研究表明中性海藻糖酶基因nth1在酵母胞内海藻糖的积累上起着关键作用。

近年来虽然通过改善工艺条件及选用先进设备等可以在一定程度上提高酒精浓度，减少能源消耗，但是要从根本上解决酵母的耐性问题还是需要利用分子生物学育种技术构建耐高温和耐用消费品高酒精浓度的酿酒酵母工业菌株。

【发明内容】：本发明目的是解决酿酒酵母菌株自身耐性不足的问题，提供一株具有耐高温和耐高酒精浓度的高耐性酿酒酵母工程菌及其构建方法。

本发明采用基因工程育种技术选育获得的耐高温耐酒精的酿酒酵母菌株，可以更好地适合酒精浓醪发酵的要求，能够为酒精发酵工业带来显著的经济效益。

本发明所提供的酿酒酵母工程菌，是将酿酒酵母中的中性海藻糖酶基因敲除，得到高海藻糖含量的酿酒酵母工程菌株，保藏号为CGMCC No 2666，命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae AY-18。

本发明所述的高耐性酿酒酵母工程菌的构建方法，是通过构建的同源重组质粒，采用同源重组的方式敲除酿酒酵母中编码中性海藻糖酶基因NTH1，降低酵母细胞内生物活性保护物质海藻糖的分解，获得耐高温耐酒精的酿酒酵母工程菌株。所述中性海藻糖酶(NTH1)的氨基酸序列的GenBank号为CAA88061。

所述酿酒酵母(受体菌)可为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS 2.14(中国微生物菌种保藏管理委员会，公众可以通过该保藏管理委员会获得出发菌株AS2.14)。

本发明方法所述的中性海藻糖酶的编码基因NTH1是通过构建的重组质粒pUC-NK进行敲除的；所述重组质粒pUC-NK的物理图谱如图4所示。该构建方法的具体操作过程如下：

第一、编码酵母中性海藻糖酶NTH1基因的获得

根据已报道酵母中性海藻糖酶NTH1的基因序列，设计上下游引物，进行NTH1基因的PCR扩增，引物序列为：

上游引物P1：5＇-CGTCAGCTTAGCGCTAGGC-3＇

下游引物P2：5＇-CAATGCCTACCATCCGATCGC-3＇

以酵母总DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增；PCR条件：P1、P2各10mmol/L及1/10体积的10×PCR缓冲溶液，0.2mmol/L的dNTP和2U的Taq DNA聚合酶，以20μL系进行扩增；扩增条件：先95℃变性5min，然后95℃变性40s，58℃退火60s，72℃延伸2min，共25个循环；最后72℃延伸8min使产物延伸完全；PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条约2.2kb的特异性条带，其大小与预期相当，即为编码酵母中性海藻糖酶NTH1基因；

第二、重组载体pUC-NK质粒的构建

将上步纯化后的PCR产物，经EcoRI-NdeI双酶切后，插入载体pUC19的EcoRI和NdeI酶切位点之间，构成pUC-N质粒；用HindIII-SacI从pUG6中酶切loxp-Kanr-loxp片段，插入质粒pUC-N的HindIII和SacI酶切位点之间，构成pUC-NK质粒；