[发明专利]草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因序列

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学中的基因克隆领域，尤其涉及草鱼胞质苹果酸脱氢酶基因的核苷酸及氨基酸序列。

背景技术

苹果酸脱氢酶(MDH)广泛分布于生物体内，是一种活性非常强的酶，它催化草酰乙酸盐和苹果酸盐的相互转化反应，与二核苷酸辅酶的氧化还原相关。草酰乙酸盐在许多代谢途径中都有重要作用，包括三羧酸循环、乙醛酸旁路、氨基酸合成、糖原异生等，并维持氧化还原平衡，还能促进胞质和亚细胞器代谢物的交换。依生物体的功能不同、组织差异、细胞内定位的不同其表达种类不同，MDH具有多种同工酶形式。胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)存在于细胞胞质内，担负着将NADH转入线粒体的重任，并且还对调控三羧酸循环有作用，同时cMDH还是核酸通路(NACh)复合体的一个组成部分。但目前对cMDH的研究相对较少，且主要的研究集中在植物上。硬骨鱼类通常会表达两种平行基因形式的胞质苹果酸脱氢酶(cMDH-S和cMDH-L)，这与鸟类和哺乳动物类这些四足动物只表达一种是不同的，而cMDH-L与线粒体苹果酸脱氢酶(mMDH)很相似。目前NCBI上只能查到较少种类鱼类的cMDH的全长cDNA，而在淡水经济鲤科鱼类中克隆到苹果酸脱氢酶(MDH)尚属首次。

目前胞质苹果酸脱氢酶在草鱼基因研究上还属空白。本基因的获得可以进一步研究该基因在草鱼细胞中的组成及基因结构，并为研究该基因在草鱼生长中的作用提供更高层次的科学服务，为研究草鱼功能饲料提供理论依据和新思路。

发明内容

本发明的目的是以本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中胞质苹果酸脱氢酶EST序列为模版设计引物，结合RACE技术，用PCR法扩增克隆得到草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因的全表达序列。

上述目地是通过以下技术方案来实现的：

取出新鲜草鱼肠道组织，采用TRIzol(Invitrogen Corporation)一步法提取总RNA，甲醛变性凝胶电泳和DNA/RNA calculator(Qenequant)检测总RNA质量。

本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中筛选到胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)EST序列，经测序比对后发现该EST序列具有胞质苹果酸脱氢酶cDNA的完整3′端，欠缺cDNA序列的5′端。利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的5端进行扩增。

根据已知EST序列设计外侧和内侧两个特异引物：

5端特异引物1：5′-AGAGCTTCCTGGCCTTGATGAC-3’

5端特异引物2：5′-TGAGGAGTGATTTCCCCAGATAATC-3’

通用引物：

Long：

5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′

Short：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′

接头引物：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3′

5端核心引物：5′-(T)25V N-3′(N＝A，C，G，or T；V＝A，G，or C)

以接头引物和5端核心引物反转录合成的第一链cDNA为模版进行PCR反应，上游引物使用通用引物，下游引物使用5端特异引物1。PCR结果琼脂糖凝胶电泳胶回收后用通用引物和5端特异引物2进行PCR验证。将验证后的序列片段连接到pMD18-T质粒，转入E.Coli JM 109菌株，经质粒酶切验证后用M13通用引物测序。扩增得到片段大小为681bp。

再根据5端扩增片段和已知EST序列拼接所得结果设计引物对胞质苹果酸脱氢酶基因的开放阅读框进行扩增，引物分别为：

上游引物：5’-CACATCTCAACCTGCACAATCAGAC-3’

下游引物：5’-CAGAGGAGTAGACGCCCATAGACAC-3’

以接头引物和5端核心引物反转录合成的第一链cDNA为模版进行PCR反应，使用上下游引物进行PCR反应。PCR结果琼脂糖凝胶电泳胶回收后连接到pMD18-T质粒，转入E.Coli JM 109菌株，经质粒酶切验证后用M13通用引物测序。扩增得到片段大小为861bp。

利用vector NT对扩增所得开放阅读框序列和全cDNA序列进行比对，对全序列进行调整后获得了完整的草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因序列，既目的基因。