[发明专利]农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于植物转基因方法领域，涉及利用农杆菌介导的禾谷类作物基因转化方法，特别是玉米遗传转化的方法。

背景技术

玉米，学名玉蜀黍，属禾本科玉米属(Zea mays L.)，原产于美洲大陆的墨西哥、秘鲁及智利。玉米属于C4高产粮食作物，是世界三大粮食作物之一，在世界粮食生产中占有重要地位。

20世纪80年代以前，玉米品种更新换代主要采用常规育种方法，即通过有性杂交实现基因重组，依据表型进行人工选择，实现优良基因重组。这种方法已有上百年历史，也育成了成千上万个优良作物品种，对农业生产做出了重大贡献，但由于作物的表型性状易受外界环境条件干扰和季节的影响，育种周期长(6~8年)、规模(如土地)大，但效率却很低，预见性也差；此外，有性杂交受到种间隔离的限制，在一定程度上限制了可利用基因资源的范围。植物转基因技术的迅猛发展，推动了作物转基因育种技术的迅猛发展，不仅使作物的转基因工程技术育种成为可能，而且取得了传统常规育种技术难以达到的效果和效益。作物转基因技术已成为农业生物技术的核心领域，它正在成为作物遗传改良一种极为重要的辅助手段，世界各国纷纷将作物转基因工程育种技术作为国家战略予以推动和发展，尤其是玉米转基因工程育种技术已成为各国玉米生物技术育种的发展重点和优先领域。

玉米的转基因方法主要有两大类：农杆菌介导转化法和无需载体的DNA直接导入转化法。DNA直接导入转化法主要包括基因枪法、花粉管通道法、子房注射法、PEG法、电击法、阳离子转化法等。无论何种外源基因转化方法，都需要依靠转化细胞的脱分化和在分化这一组织培养植株的再生过程，实现外源基因的转移，获得转基因植株。

玉米组织培养效率受基因型限制较大，许多基因型材料都存在着愈伤组织诱导频率低、愈伤组织质量差、转化再生植株难、畸形苗多等现象，这直接影响了遗传转化技术的运用范围及遗传转化中转化体的筛选和植株再生。此外，试管苗存活率较低是玉米组织培养技术尚需提高的一个环节，试管苗的成功移栽是较困难的步骤，污染是组织培养过程中经常遇到的问题，褐化也是组织培养过程中经常遇到的问题。它们均不同程度地制约了玉米组织培养的成效。

花序浸蘸法(flroal dip)属于原位渗透法的一种。该方法避开了组织培养阶段，排除了因组织培养中体细胞变异所产生的对目的基因的遗传学研究及正确表达极为不利的遗传背景，同时为一些组织培养不易成苗的作物种类提供了有效的基因转移新方法。该方法与其它转基因方法相比较，其优越性在于：①不受宿主植物基因型的影响，可以将外源基因导入难以建立再生系统的植物中；②操作简单，无需经过烦琐的组织培养阶段，大大减少了产生体细胞无性系变异的可能性；③对精密仪器和昂贵药品的依赖较小，所投入的人力、物力、财力很少；④可以在短期内获得大量的转基因植株，创造大量的突变株，对功能基因组的研究意义重大。功能基因研究是基因工程研究的核心，然而功能基因组的研究要以获得大量突变体为基础，花序浸蘸法在短期内能获得大量转基因植株。因此，花序浸蘸法对功能基因组研究和转基因育种均具有深远意义。

发明内容

针对现有转基因技术的不足，本发明以花序浸蘸法为基础，提供一种高效的玉米遗传转化的方法。

1.将含有目的基因的农杆菌用转化培养液悬浮，所述转化培养液以改良的N6培养基为基本营养成分，附加物有表面活性剂CSO40、Triton X-100、乙酰丁香酮(AS)、赤霉素(GA)、6-卞氨基腺嘌呤(6-BA)、生长素(IAA)、水解酪蛋白、L-脯氨酸和甘露醇。

2.对活体进行花序浸泡法转化：在雌花花丝吐出5~10cm，雄花序主花轴有少于30％的小花散粉时，将待转化玉米植株的雌花序或雄花序浸泡于上述转化培养液中，或将上述转化培养液洒到待转化的玉米植株的雌花序或雄花序上，利用农杆菌介导，将目的基因整合到植株的目的基因组中。