[发明专利]农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法，包括以下步骤：

1)将含有目的基因的农杆菌用转化培养液悬浮，所述转化培养液以改良的N6培养基为基本营养成分，附加物有表面活性剂CSO40、Triton X-100、乙酰丁香酮(AS)、赤霉素(GA)、6-苄氨基腺嘌吟(6-BA)、生长素(IAA)、水解酪蛋白、L-脯氨酸和甘露醇；转化培养液中CSO40的用量为30～300μl/L，Triton X-100的用量为10～100μl/L，AS的用量为10～30mg/L，GA的用量为1～5μg/L，6-BA的用量为0.5～2μg/L，IAA的用量为0.5～1mg/L，水解酪蛋白的用量为100～500mg/L，L-脯氨酸的用量为0.5～2mg/L，甘露醇的用量为10～20mg/L；

2)在对活体进行花序浸泡法转化：在雌花花丝吐出5～10cm，雄花序主花轴有少于30％的小花散粉时，将待转化玉米植株的雌花序或雄花序浸泡于上述含有农杆菌的转化培养液中，或将上述含有农杆菌的转化培养液喷洒到待转化的玉米植株的雌花序或雄花序上，利用农杆菌介导，将目的基因整合到植株的目的基因组中。

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法，其特征在于：所述含有农杆菌的转化培养液是通过农杆菌培养及储备液制备的，农杆菌培养及储备液是

3)取-70℃保存的含有目的基因的农杆菌，迅速溶解，重悬，于含卡那霉素50mg/L和潮霉素50mg/L的YEB固体培养基平板上划线，28℃过夜培养；

4)挑取单菌落接种于5ml含Kan和Hyg的YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12～16h；

5)取2ml菌液转接于100ml含Kan和Hyg的YEB液体培养基中，220rpm28℃振荡培养12～16h；

6)监测其OD₆₀₀值，当OD₆₀₀＝2.0时停止摇菌，至于4℃冰箱，以备转化使用；

所述含有目的基因的农杆菌的获得是将目的基因插入pCAMBIA1302表达载体中，再将该表达载体转化入农杆菌中。

3.根据权利要求2所述的农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法，其特征在于：所述农杆菌选自下列菌株：C58、EHA105、LBA4404。

4.根据权利要求2所述的农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法，其特征在于：所述步骤2)的转化过程为：将雄花序完全浸没于转化培养液中，并不时轻摇，保持5～8min，间隔30～60min后再次浸泡，共浸泡3～4次；将雌花序浸没于转化培养液中，并不时轻摇，保持1～1.5min，间隔30～60min再次转化，共转化3～4次；转化后雄花先套透明塑料袋，外套雄花袋，直至散粉；雌花套硝酸纸袋，24h后即可去掉纸袋授粉。

5.根据权利要求4所述的农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法，其特征在于：所述步骤2)的转化过程，转化时间应选择在清晨和傍晚时进行，气温25℃～30℃，避免在下雨时进行，转化前一天不浇水。