[发明专利]一种肝细胞和枯否细胞的体外共同培养技术

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物细胞的体外培养技术，特别地，涉及一种肝细胞和肝枯否细胞(又称：Kupffer细胞)的体外共同培养技术。

背景技术

肝脏是人体中的重要器官，具有合成、代谢、解毒等功能。原代肝细胞的体外培养有着广泛的应用价值，如研究肝细胞的生理、病理，应用于细胞移植、药物学检测等，同时还可用于作为生物型人工肝(Bio-artificial Liver，BAL)生物反应器的的主体细胞。体外培养肝细胞技术的优化是研制开发BAL生物反应器的核心与关键之一。

然而，将分离的肝细胞用于上述多种用途中存在的主要问题之一是原代肝细胞在体外培养的时间短，且很多分化功能是瞬时的，在培养物中仅持续几小时至几天，限制了肝细胞的应用。

一些研究报告认为，肝细胞与非实质细胞在体外共同培养，更接近肝细胞在体内生存环境，有利于延长肝细胞生存时间并保持功能。然而，这些研究均是采用含有多种细胞成分的非实质细胞与肝细胞混合培养，且无固定的培养流程和标准化操作程序(standard opration procedure)。

在肝脏的非实质细胞中，Kupffer细胞是数量仅次于窦状内皮细胞(SEC)的另一肝非实质细胞，约占肝脏非实质细胞的25-40％，属巨噬细胞，主要起着清除内毒素、细菌、病毒和肿瘤细胞的功能，是机体防御系统的重要组成部分。但肝细胞和Kupffer细胞在一个培养体系中共同培养，由于这两种细胞属不同种类的细胞，体外培养条件与体内环境相差大，因此要在体外建立一个标准化、简单易行的培养体系，实现两种细胞既能良好存活生长、并且能同时呈现两种细胞的功能具有相当大的难度。

1994年，汪谦等人(大鼠肝细胞、Kupffer细胞和Ito细胞的分离与培养.中华实验外科杂志.1994，11(2)：72-72)在研究中提及将大鼠肝细胞、Kupffer细胞和Ito细胞这三种细胞两两或三位一体混合培养比单独培养在形态学和功能上都显示优越，但该论文中未论及具体如何培养。

发明内容

本发明主要针对现有技术的不足，提供一种在普通培养条件下肝细胞和Kupffer细胞的体外共培养技术，该技术可延长原代肝细胞的体外培养时间，且保持肝细胞的功能，可用于构建生物型人工肝支持系统、药物学检测、肝细胞移植、生产白蛋白等。

本发明所述的技术方案包括：

一种肝细胞和Kupffer细胞的体外共同培养技术，其特征是将肝细胞和Kupffer接种于含80-120ml/L小牛血清，110-135u/L胰岛素，90-110μg/L胰高血糖素，90-110μg/L氢化可的松，1.0-3.0g/L NaHCO3，8-120万U/L青霉素的pH为7-7.5的DMEM培养基的培养板上，置于恒温37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，培养24h后倒去培养上清，用培养液冲洗，每天换液；其中肝细胞和Kupffer细胞数量比在9-15:1之间；优选方案，二种细胞的数量比为10-14:1；比较优选地方案，二种细胞的数量比为11-13:1；最优选方案，二种细胞的数量比为12:1。

本发明比较优选的技术方案：

乳猪肝细胞和Kupffer细胞的体外共同培养技术，其特征在于肝细胞和Kupffer细胞的数量比在9-15:1之间；优选方案，二种细胞的数量比为10-14:1；比较优选地方案，二种细胞的数量比为11-13:1；最优选方案，二种细胞的数量比为12:1。

研究表明，肝细胞和Kupffer细胞二者比例在9-15:1之间，肝细胞和Kupffer细胞在体外存活时间明显延长，且具有较好的肝细胞功能，能对安定和乙酰氨基酚的清除率较高；尤其二者数量比为12:1时，肝细胞和Kupffer细胞在体外存活时间最长，对安定和乙酰氨基酚的清除率最高。

在本发明中，用于获得肝细胞的肝脏供体优选是哺乳动物的正常的或者转基因动物，比较优选的是人、狒狒、猪、牛、马、犬或羊等；最优选的是人、猪。

对于在生物型人工肝生物反应器的应用，肝细胞和Kupffer细胞的肝脏供体来源比较优选的是猪供体，尤其是乳猪供体。优选猪龄在2个月之内，比较优选为1个月之内，更优选在20天之内；优选猪体重在20kg之内，比较优选在10kg之内，更优选在5kg之内。

细胞分离