[发明专利]破骨细胞V-ATP酶质子泵亚基ATP6vlcl的RNA干扰靶点及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，涉及破骨细胞V-ATP酶质 子泵亚基ATP6v1c1(简称C1)序列上用于RNA干扰的干扰靶点，以及针对 这些靶点的以各种方式获得的小干扰RNA分子以及其在制备治疗骨质疏松症 的药物中的应用。

背景技术

骨质疏松症是发病率高、死亡率高、保健费用消耗大的最常见的骨代谢疾 病。据估计，半数以上的妇女和大约三分之一的男性在其生存期内会发生骨质 疏松性骨折。骨折给人们的生活带来极大的痛苦，轻者使人们生活质量下降， 重者将导致瘫痪(如股骨骨折)并由此引发很多并发症甚至导致死亡。这些疾 病的产生与破骨细胞(Osteoclast)的过度活跃有关。破骨细胞与成骨细胞 (Osteoblast)是骨中的两类重要细胞，分别负责骨吸收与骨形成，两者之间的平 衡保证了成年动物及人类骨量的恒定；然而在破骨细胞的活性大于成骨细胞活 性的时候，破骨细胞对骨的吸收大于成骨细胞的骨形成作用，导致骨密度下降 最终出现骨质疏松，对于这些疾病的治疗必须抑制破骨细胞的活性。

破骨细胞皱褶缘V-ATP酶负责破骨细胞的细胞外酸化过程，使骨去矿化 并为蛋白酶降解骨有机成份提供酸性微环境。发明人通过Micrroarray数据分 析首次发现C1在破骨细胞中高表达而不是C2，因此，C1是C亚基在破骨细 胞中的特异亚型，即C1是破骨细胞V-ATP酶具有的特异亚基。抑制破骨细胞 C1的表达导致破骨细胞细胞外酸化和骨吸收功能下降。在多核破骨细胞中， 骨吸收发生在致密的缝合区(sealing zone)内，缝合区包围着浆膜异化的皱褶 缘。缝合区由含actin的黏附结构，即podosome所构成，这一结构处于高度动 态平衡中，podosome由小的丝状肌动蛋白(F-actin)柱为中心，外周围绕着 蛋白如粘着斑蛋白(vinculin)和桩蛋白(paxillin)所构成。从皱褶缘分泌的 质子和酶被封闭在缝合区内的吸收腔隙。但体外培养在玻璃或塑料表面的成熟 破骨细胞，其podosome在细胞外周形成一条环形的带状结构。发明人发现抑 制破骨细胞C1的表达使破骨细胞不能形成规则的丝状肌动蛋白纤维环，即抑 制破骨细胞C1的表达会导致破骨细胞缝合区形成缺陷。因此，C1可以作为药 物靶点特异抑制破骨细胞的活性。本发明设计和体外慢病毒表达C1-ShRNA 用于抑制破骨细胞的骨吸收活性，以达到治疗骨质疏松等骨相关疾病的目的。

发明内容

本发明的一个目的在于提供破骨细胞V-ATP酶质子泵亚基ATP6v1c1(简 称C1)的RNA干扰靶点，针对该靶点设计人工序列，并将该序列在表达载体 中进行表达获得小干扰RNA分子(SiRNA)，并构建重组慢病毒表达载体。因 此本发明的目的也在于提供针对C1的小干扰RNA分子，包含该小干扰RN A分子的表达载体以及由其转化的慢病毒表达载体，此外，由表达载体表达产 生的、作为小干扰RNA分子前体的短发夹结构RNA分子(ShRNA)也包含在 本发明中。

本发明的另一目的在于提供C1的RNA干扰靶点在制备治疗骨质疏松药 物中的应用。

根据本发明的一方面，根据破骨细胞V-ATP酶质子泵亚基ATP6v1c1的 mRNA序列体外合成抑制C1基因表达的双链小干扰RNA(SiRNA)片段的 DNA序列，并克隆到短发夹结构RNA(ShRNA)的表达质粒上，表达并筛选 对破骨细胞吸收抑制作用较强的C1-SiRNA，确定RNA干扰靶点序列，SEQ ID NO.1～3为针对C1的RNA干扰靶点序列，优选的RNA干扰靶点具有如 SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。SEQ ID NO.4～5为针对干扰靶点序列1的 设计的用于表达SiRNA的DNA序列，SEQ ID NO.6～7是针对干扰靶点序列2 设计的用于表达SiRNA的DNA序列，SEQ ID NO.8～9是针对干扰靶点序列3 设计的用于表达SiRNA的DNA序列，每对序列均为互补序列。具体序列见 表1和表2.

SiRNA分子为双链RNA分子，一单链含有RNA靶点序列和在3’末端的 UU双核苷酸尾(如SEQ ID NO.10所示)，另一单链为互补链，双核苷酸尾 UU同样位于3’末端。SiRNA进入细胞后直接干扰目标基因的表达。

表1  C1 RNAi靶点序列

表2  合成用于表达siRNA的DNA序列