[发明专利]零背景构建重组杆状病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白工程领域，具体是一种构建重组杆状病毒的方法。

背景技术

昆虫杆状病毒表达系统是20世纪80年代发展起来的真核表达系统，它具备所有真核表达系统翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化、磷酸化、信号肽切除等，表达出的重组蛋白具有天然蛋白的生物学功能。Smith等(1983)用苜宿银纹夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒(AcMNPV，Autographacalifornica multiple nucleocapsid nucleopolyhedrovirus)作载体在草地夜蛾细胞Sf-21中高效表达人β-干扰素的研究成果开拓了杆状病毒作为载体表达外源基因的新领域。目前，利用杆状病毒表达系统表达外源基因的来源遍及病毒、细菌、真菌、动物和植物等各种生物，其应用范围涉及蛋白质结构和功能、蛋白质与蛋白质之间相互作用方面的基础研究和疫苗生产、疾病诊断以及病毒杀虫剂的改良等。杆状病毒由于基因组庞大，外源基因的克隆不能象细菌或酵母载体一样通过酶切连接的方式直接插入，而必须通过转移载体的介导。因此如何高效快速地构建重组杆状病毒成为利用杆状病毒表达外源基因的最关键一步。

目前构建重组杆状病毒方法有传统的昆虫细胞内同源重组，细菌内重组即Bac-to-Bac系统，以及直接连接等三种方式。其中昆虫细胞内同源重组和直接连接由于重组效率低，转座背景高，需要多轮空斑纯化，耗时费力，现在已经很少有研究者使用。目前最常用的杆状病毒表达系统是细菌内重组即Bac-to-Bac系统，其本质上是将NPV基因组DNA改造成可在细菌内复制并能与供体质粒在细菌内发生转座且同时对昆虫细胞保留感染性的大型穿梭载体。其转座原理基于Tn7转座子的专一位点转座系统，它通过将杆状病毒DNA改造成可在大肠杆菌菌株中复制的Bacmid载体，即在杆状病毒基因组中含有可在大肠杆菌复制的F因子复制子，卡那霉素抗性基因，Tn7转座接触位点以及lacZ′盒式结构，由于杆状病毒基因组为环状闭合双链DNA分子，因此这种Bacmid可以像质粒一样在大肠杆菌中以低拷贝形式复制。而在转移载体中外源基因位于多角体启动子的驱动下，两端分别为Tn7转座子的左、右端转座序列，当将重组转移载体转化到含有Bacmid的大肠杆菌中后，在辅助质粒提供的转座酶的介导下进行转座，将重组转移载体上含外源基因的表达盒式结构转座到Bacmid的lacZ′盒式结构中，破坏α互补，因此重组病毒可以通过简单的蓝白斑方法筛选，从白色菌落中分离的重组病毒DNA直接转染昆虫细胞即可以获得有感染性的重组病毒粒子。

然而即使是Bac-to-Bac系统，虽然其不需要在昆虫细胞内进行同源重组，但在细菌内转座效率也不是非常高，通常只10％左右的白斑，而且白斑菌落需要进一步划线培养和PCR验证以去除假阳性，比较耗时复杂。现有方法基本能够满足在构建单个或者少量重组病毒，一旦需要构建数十个甚至更多的重组病毒大量表达外源基因时则效率太低。而且由于获得重组病毒的效率少于90％，不合适构建高质量库容量大的杆状病毒cDNA文库。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建重组杆状病毒的方法，可去除转座中的背景干扰，避免复杂的PCR验证和繁琐的空斑纯化，真正做到高效快速构建重组杆状病毒。

本发明所述的构建重组杆状病毒的方法按下述步骤实现：(1)构建以R6Kγ作为复制子的供体质粒，并按常规方法引入外源基因；(2)封闭DH10Bac宿主菌基因组上的attTn7受体位点，获得DH10BacΔTn7；(3)常规方法转化重组供体质粒进入DH10BacΔTn7获得重组杆状病毒；(4)常规方法制备重组Bacmid DNA转染昆虫细胞。

本发明供体质粒以R6Kγ作为复制子，DH10BacΔTn7中封闭了宿主菌上的attTn7受体位点，两种策略的单独使用都可以提高转座效率。

本发明的理论依据：Bacmid宿主菌E.coli DH10B基因组内存在有Tn7转座受体位点(attTn7)，这些受体位点会与Bacmid中的attTn7竞争，造成目标转座效率下降；另一方面以pUC为基本骨架的转移载体和具有F因子复制子的Bacmid在宿主菌中可以共存，使得抗性筛选背景非常高，增加了获得重组病毒的程序和时间。R6Kγ复制子的复制依赖于宿主菌pir基因的表达产物Rep蛋白π，如果在转移载体中利用R6Kγ作为复制子，这样就可以避免转移载体以质粒的形式和Bacmid在宿主菌中共存的问题，减少抗性筛选背景；封闭宿主菌基因组中的attTn7位点，就避免了这些受体位点与Bacmid中的attTn7竞争，解决了目标转座效率下降的问题。

有益效果：